目前，ImmuHub®免疫组文库构建平台根据样本情况和研究目的主要分为两种技术路线：
1. 多重PCR引物建库：以DNA为模板，针对CDR3区设计多对引物，扩增出CDR3区段，再进行文库构建并测序。
2. 5’RACE单对引物建库：以mRNA为模板，在恒定区设计引物逆转录扩出TCR或BCR的全长序列，再进行文库构建并测序。
▲ 图1. ImmuHub®技术路线
艾沐蒽可根据不同样本类型和研究需求为客户提供个性化的文库构建和测序模式，通常使用5’RACE或多重PCR文库构建方法。如果符合RNA提取条件，一般首选推荐RNA+5’RACE方法。此种建库方法有其独有的技术优势（技术流程如上左图）。
基于5’RACE原理，引入UMB（Unique Molecular Barcode，独立分子条形码）进行文库构建。每个样本检测中，在原始RNA模板扩增前加入的UMB种类可高达约1700万种（图2），这可对后续PCR扩增或测序过程中的错误进行有效纠正，还原真实的数据，有效杜绝PCR扩增错误和测序错误，从而提高结果准确率。
▲ 图2. 基于UMB的纠错
（1）通过将具有相同UMB的reads聚集在一起可以有效矫正PCR扩增和测序错误，避免由于实验误差产生的新序列，解决了假高多样性（图3）；
▲ 图3. UMB技术修正了PCR扩增和测序错误，还原真实的免疫组多样性（蓝bar），避免了假高多样性（红bar）
（2）通过计数每种UMB的数目可以还原PCR扩增前的真实RNA序列比例，更真实地反应样本单克隆T/B细胞的情况（图4）。
▲ 图4. UMB技术消除PCR扩增序列，还原了PCR扩增前的真实单克隆T/B细胞比例（蜗牛图中1的部分）
多重PCR引物建库法使用一组与已知V基因互补的正向引物和一组与J或C区域互补的反向引物。此种方法因同时进行几十对引物的扩增，体系异常复杂，且多种引物扩增效率可能存在偏倚，难以等效扩增，即使再优化调整，也无法和单对引物的等效扩增相比。因为5’RACE单对引物建库因仅采用一对引物进行扩增，可有效减少PCR扩增偏好性。在某些样本中，用多重PCR引物扩增方法，就极容易扩增出来某一种的V基因片段，表现为样本中频率最高的V基因片段都相同（图5下），而用5’RACE的方法可以看到这些不同样本中频率最大的V基因片段都是不同的（图5上）。
5’RACE单对引物建库法能够得到包含完整TCR/BCR，这意味着可以保留完整的V基因序列，即可以扩增VDJ全长序列，同时又由于是根据C区设计引物，还可得到C基因信息，如对BCR测序，还可得到IgH isotype信息。此种方法能够匹配多种不同测序模式，PE150/PE250/PE300均可。而多重PCR方法仅能扩增CDR3区。
▲ 图6. 5’RACE单对引物建库与多重PCR引物建库扩增区域
综上，ImmuHub®免疫组测序技术平台是非常灵活的一个文库构建平台，能根据样本情况和研究目的匹配。当能同时提取RNA或DNA时，我们首选使用RNA+5-race方法建库后，再进行高通量测序可获得更为准确和全面的TCR/BCR信息。
▲ 图7. ImmuHub®技术方法与优势
部分基于ImmuHub®平台发表的学术论文：www.immuquad.com/publications
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