2023年11月18日，浙江大学医学院附属儿童医院徐晓军教授团队在国际高水平期刊Nature Communications（IF：17.694）上发表了题为”Minimal residual disease detection by next-generation sequencing of different immunoglobulin gene rearrangements in pediatric B-ALL“的研究论文，这是目前国内发表的影响因子最高的关于免疫组NGS MRD检测的文章。
该研究中所有样本的NGS-MRD检测均采用艾沐蒽自主开发的Seq-MRD®技术。这项研究利用二代测序技术（NGS）开展淋巴细胞免疫球蛋白（Ig）重链和轻链基因重排检测，在初诊时、诱导治疗结束、巩固治疗结束等多个时间点进行检测，评价其作为监测B系急性淋巴细胞白血病微小残留病（MRD）方法的临床价值。该医院单位是国内最早利用二代测序技术检测B-ALL MRD的单位之一，于2018年11月份起将Seq-MRD®检测纳入到B-ALL的诊治体系中。
下面就让我们一起来详细了解一下吧！
研究背景
基于MRD状态的治疗策略改善了儿童ALL的预后，灵敏度和准确度更高的NGS MRD检测方法更加增强了对治疗后复发风险的识别，并允许在监测的每个时间点识别新出现的克隆。以往的临床研究主要集中在IGH的NGS的预后意义上，但对于IGK和IGL轻链位点的预后价值存在认知差异。本研究旨在确定IGH和轻链（IGK/IGL）MRD测量在儿童B-ALL中的预后价值。
研究方法
共纳入430例儿童B-ALL患者，所有患儿均按ZJCH-ALL-2019化疗方案治疗。分别在初诊时、第5周的诱导化疗结束时(EOI)和第13周的巩固治疗结束(EOC)时采集骨髓由杭州艾沐蒽生物科技有限公司进行NGS-MRD检测。中位随访时间为20.7个月。
研究结果
Ig克隆重排的分布模式
在399例具有可追踪克隆的B-ALL患者中，377例儿童检测到724个IGH克隆（包括IGH-DJ）重排，176例儿童检测到266个IGK克隆（包括IGKDE）重排，68例儿童检测到83个IGL克隆重排。大多数患儿表现为Ig多克隆模式。克隆具体分布情况如图1所示。
图1.Ig克隆重排的分布特征
大多数儿童表现出1到3个克隆重排（图1A）。IGH、IGK、IGL克隆数及对应的患者个数分布如图1B所示。有22例患者没有可追踪的IGH克隆，但有IGL和（或）IGK进行跟踪（图1C）。这表明IGK/IGL可使另外5.5%样本获得MRD监测标志。不同年龄组间的克隆型数分布也存在差异（图1D），在IGH类别中，10岁以上儿童大多表现为单克隆重排，而在IGK/IGL类别中，无论是1-10岁还是10岁以上儿童均表现为一个克隆重排的优势。
Ig克隆重排的清除模式
图2.不同克隆频率的IGH、IGK和IGL的克隆清除模式
60.9%的克隆在EOI阶段被清除，31.4%的克隆在EOC时被清除(图2A)。IGH、IGK和IGL显示出相似的清除模式，大部分克隆在EOI时被清除（图2B-2D）。IGH、IGK和IGL之间的克隆清除时间没有显著性差异（图2E）。
作者还研究了不同大小的克隆的清除模式。如图2F所示，高频克隆的清除率明显慢于相对低频克隆的清除率。EOI时，频率<10%的IGH克隆清除率比频率>50%的克隆更高（77.5% vs 54.2%；P <0.001）（图2G-2H）。IGK和IGL克隆的早期清除率也是同样的趋势（图2I-图2L）。
比较IGH-MRD与IGK/IGL-MRD的一致性
图3.IGH-MRD与IGK/IGL-MRD之间的一致性
在EOI时，若以灵敏度0.01%作为cutoff，则IGH-MRD和IGK/IGL-MRD的一致率为79.9%；在更高的灵敏度水平（0.0001%）下，IGH-MRD和IGK/IGL-MRD的一致率为68.9%（图3A)。在EOC时，绝大多数的克隆已被完全根除或低于0.0001%，当以0.0001%为cutoff时，IGH和IGK/IGL一致率为88.4%（图3B）。
NGS-MRD的预后分析
如果IGH、IGK或IGL的任何克隆型为阳性，则NGS-MRD定义为阳性。NGS-MRD根除与临床/实验室特征及生存率之间的关系如图4所示。
图4.NGS-MRD与临床/实验室特征及生存率之间的关系
年龄大于10岁或分为高危组的患者在EOI时NGS-MRD水平更高，且高危组的患者在EOC时NGS-MRD水平仍显著偏高（图4A-4B）。关于基因特性，ETV6-RUNX1融合基因的患者NGS-MRD水平显著低于其他融合基因。染色体核型与NGS-MRD无关（图4C-4D）。
在长期生存率方面，EOI时,NGS-MRD<0.01%患者3年EFS显著优于≥0.01%组(97.3% vs 83.3%,P=0.002);在EOC时,NGS-MRD<0.0001%患者3年EFS显著优于≥0.0001%组(96.4% vs 75.7%,P<0.001)。这提示EOI时0.01%和EOC时0.0001%可能是适宜的cutoff。
MFC和NGS MRD的不一致及临床意义
图5.MFC和NGS MRD的不一致及临床意义
在EOI时，传统的流式技术（MFC）检测MRD同样有预后价值（图5A）。但是在MFC和NGS MRD不一致的病例中，有93例是MFC-MRD阴性而NGS-MRD阳性，这些患者的3年EFS不如MFC和NGS MRD均阴性的患者（84.7% ± 7.1% vs. 97.0% ± 1.2%，P = 0.008）；只有3例患者为MFC阳性而NGS阴性，至最后一次随访时他们均存活（图5B）。说明相比于MFC，NGS的检测灵敏度更高，准确度更高。
IGH、IGK和IGL MRD的预后分析
图6.NGS检测的IGH、IGK和IGL MRD的预后价值
将MRD水平分为<0.0001%、≥0.0001%且<0.01%、≥0.01%三类，分别评估IGH、IGK、IGL MRD的预后。发现在EOI时,仅IGH-MRD与预后相关（P=0.034）（图6A）。在EOC时,IGH和IGL MRD与预后相关（IGH：P<0.001；IGL：P=0.017）（图6B、F）。IGK-MRD与预后无关，无论在EOI还是EOC（图6C、D）。这说明IGH是MRD监测的关键指标。
IGH和IGK/IGL MRD的不一致及临床意义
图7.IGH和IGK/IGL MRD之间的不一致情况
在EOI时，当考虑IGK/IGL结果，有28例IGH MRD<0.0001%的患者被划分到更高水平组（图7A），其中2例患者出现复发或死亡。EOC时有20例IGH MRD<0.0001%的患者被分配到更高水平组（图7B），有1例患者出现复发。
将患儿分为三组：IGH+（不论IGK/IGL阳性或阴性）、IGH–IGK/IGL–、IGH–IGK/IGL+。EOI时以0.01%为cutoff，在18例IGH–IGK/IGL+的患者中有2例复发，IGH−IGK/IGL +患儿的EFS低于IGH−IGK/IGL−患儿（P =0 .032）（图7C）。EOC时以0.0001%为cutoff，IGH−IGK/IGL+儿童的EFS与IGH−IGK/IGL−儿童无显著差异(图7B)。说明IGK和IGL-MRD的独立预后价值较为有限。这也印证了另一项成人ALL的研究结论（详见NGS-MRD在接受造血细胞移植的成人ALL中的预后价值）。
研究结论
本研究证明采用二代测序技术平台Seq-MRD®监测儿童B-ALL治疗后MRD水平，提高了MRD检测的灵敏度及与预后的相关性。EOI时NGS-MRD<0.01%、EOC时<0.0001%的患者预后良好。IGH是MRD监测的关键指标，IGK和IGL的独立预后意义有限。
技术原理
每种B/T淋巴细胞表面均存在一种特异性B细胞受体（B cell receptor,BCR/Ig)/T细胞受体 (T cell receptor,TCR)，由于BCR/TCR因中V、D、J基因片段重组与碱基的随机插入、删减，导致BCR/TCR具有高度多样性的特点，从而BCR/TCR可作为每个B/T淋巴细胞唯一的分子标签。
淋系血液癌症患者因B/T淋巴细胞发生癌变，癌细胞继而自我复制形成克隆性增殖，因此，通过检测B/T淋巴细胞表面受体BCR/TCR可以鉴定癌细胞并追踪检测癌细胞的动态变化。
检测类型
1.癌细胞克隆性检测
通过患者初诊或癌细胞高负荷时的骨髓样本，找到癌细胞特有的DNA“标签”序列。
2.MRD追踪检测
利用筛查出的DNA“标签”序列，在治疗期间或治疗后评估MRD水平，监测癌细胞含量，同时检测识别新出现的癌细胞序列。
适用人群
1. B系血液系统癌症
急性/慢性B淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、B型淋巴瘤。
2. T系血液系统癌症
急性/慢性T淋巴细胞白血病、T型淋巴瘤。
意义
Seq-MRD®能提供高精度、高灵敏度的MRD检测解决方案，可帮助医生更准确地评估癌症患者的治疗反应和预后。这些技术在现代肿瘤治疗中扮演着越来越重要的角色，因为它们能够帮助医生识别那些患病复发风险高的患者，并为他们提供更个性化、更有针对性的治疗方案。
获得欧盟CE资质认证
Seq-MRD®获得欧盟CE资质（注册号：DE/CA20/01-IVD-Luxuslebenswelt-190/22），获批的是人淋巴B细胞微小残留病基因检测试剂盒（可逆末端终止测序法）。
获得三项发明专利
艾沐蒽推出的Seq-MRD®血液癌症MRD检测是最早批实现商业化的产品，自2016年研发专利技术至今，艾沐蒽Seq-MRD®已经获得3项国家发明专利：
[1]“一种应用于高通量测序检测T细胞白血病微小残留病的引物组合及试剂盒”（专 利 号: 2016 11204857.0，授权公告号:CN 106957906 B）
[2]“一种检测微小残留病MRD的试剂盒”（专 利 号: 2018 1 1550133.0，授权公告号: CN 109652518 B）
[3]“一种检测微小残留病MRD的方法”（专 利 号: 2018 1 1549203.0，授权公告号: CN 109680062 B）
发表相关文献
Seq-MRD®发表相关文献
Huang Y, Zhao H, Shao M, Zhou L, Li X, Wei G, Wu W, Cui J, Chang AH, Sun T, Hu Y, Huang H. Predictive value of next-generation sequencing-based minimal residual disease after CAR-T cell therapy. Bone Marrow Transplant. 2022 Jun 1. doi: 10.1038/s41409-022-01699-2. Epub ahead of print. PMID: 35650329.（点击链接可查看文章内容）
获得国际市场认可
2023年DelveInsight公司发布的MRD国际市场研究报告中，艾沐蒽/Seq-MRD®是中国唯一一家公司/产品进入国际调研市场报告。DelveInsight是一家领先的医疗保健市场研究和商业咨询公司，以其现成的联合市场研究报告以及为医疗保健行业的公司提供的定制解决方案而闻名。
杭州艾沐蒽生物科技有限公司成立于2016年，是国际前沿的专注于免疫驱动医学技术的国家高新技术企业。创始人团队来自美国芝加哥大学，在2010年开始使用免疫组基因高通量测序技术开展各种疾病相关研究，于2016年通过自主研发，全国首家推出NGS-MRD血液肿瘤微小残留病（MRD）检测Seq-MRD®，并授权泛生子（纳斯达克代码：GTH）使用。同时，公司拥有Immun-Traq®肿瘤治疗伴随诊断、Immun-Cheq® |T细胞免疫测评以及ImmuHub®免疫组测序科研服务产品，并布局有基于AI机器学习算法的T-classifier®肿瘤早筛、单细胞测序、TCR-T和抗体发现等平台管线。公司构建几十项发明专利和软件著作权为核心的自主知识产权体系，为医院临床、生命科学研究、新药开发等提供解决方案和产品。艾沐蒽专注于通过解码适应性免疫系统来改变疾病的诊断和治疗，并致力于推进免疫驱动医学领域发展。
