BCR抗体库测序应用 | 揭示肿瘤浸润B淋巴细胞免疫特征

本文介绍了在肿瘤微环境（TME）中B细胞在肿瘤免疫学领域中的作用，并且指出目前关于研究TME中B细胞所编码的抗体库的数据相对较少。在这作者采用B细胞受体高通量测序（BCR-Seq）来分析肿瘤浸润淋巴细胞B细胞（TIL-Bs）的抗体库特征，并将其与三阴性乳腺癌小鼠模型中来自三个解剖部位的B细胞进行比较。结果表明，TIL-Bs表现出了独特的抗体库，包括高的克隆偏极性和高体细胞高突变率，这表明局部存在抗原驱动B细胞的反应。重要的是，TIL-Bs是高度突变但没有发生类别切换，这表明类别切换重组可能在TME中被抑制。通过追踪TIL-B克隆在各种组织中的分布，可以发现它们在TME中移动。这些数据表明，抗体库特征是识别肿瘤反应性B细胞的良好指标。

B细胞和T细胞是免疫系统中不同的效应细胞;然而，它们经常协同作用以根除病理过程。二十多年来，对肿瘤免疫反应的研究主要集中在T细胞上，B细胞在肿瘤微环境(TME)中的作用仍然存在争议(1,2)。然而，最近的研究表明，B细胞可能在肿瘤免疫中起着至关重要的作用，因为这些细胞始终是构成TME的重要成分。事实上，据报道，肿瘤浸润性淋巴细胞B细胞(TIL-Bs)在不同类型癌症的TILs中占40%(3,4)。此外，一些报道显示了三级淋巴结构(TLS)含有相对较高比例的TIL-Bs。

由于BCR的下一代测序(NGS) (BCR-Seq)的进步，由于B细胞受体(BCR)存在，使B细胞膜上的抗体也可以进行分析，这彻底改变了我们对B细胞介导的免疫的理解。这项技术配合先进的计算工具，已经能够探究巨大的抗体多样性，这反过来又为B细胞在受到刺激发生哪些反应提供了重要信息(22)。

为了探究B细胞在TME中的功能作用，作者对来自TNBC诱导小鼠的四种组织类型(肿瘤、DLNs、血液和骨髓)的B淋巴细胞进行了BCR-Seq。为了确定与肿瘤细胞/TAAs结合的B细胞的特征和在TME和邻近DLNs中发生抗原驱动反应后是否受到阳性选择过程的影响，将TIL-B克隆的抗体库测量结果与其他三种组织类型中的B细胞克隆的测量结果进行了比较。

结果发现TIL-B区室有限数量的高度扩增的克隆占据主导，这些克隆表现出了高SHM率。这些克隆大多是IgM⁺克隆，这表明TIL-Bs的CSR受损。此外，在所有的区室中都发现了一个特定的TIL-Bs亚群，这表明这个特定的B细胞亚群在TME发生迁移。

无论是在时间上还是在组织之间，跟踪B细胞克隆，都可以通过识别它们的抗体可变区，特别是它们的重链(CDRH3)的互补性决定区3 (CDR3)来实现，这被用作B细胞克隆的“条形码”。由于CDRH3是V(D) J重排的产物，它在抗体重链可变区(VH)中表现出最高的多样性，被认为在抗原识别中起关键作用。

由于人们普遍认为IgM到IgG的CSR代表了免疫反应的进展(34,35)，因此将分析重点放在IgG和IgM同型的抗体VH上。为了研究TIL-Bs 的库测量并跟踪其在组织中的克隆分布，通过建立了一个实验和计算平台，用于分析4只接受4T1细胞治疗的小鼠(与2只未接受4T1细胞治疗的小鼠作为对照)获得的VH序列(图1A)。

在肿瘤细胞接种后23 d，从4种组织类型(肿瘤、血液、DLNs和骨髓)中收集B细胞，裂解纯化总mRNA。将回收的mRNA逆转录生成cDNA，并利用VH特异性引物和IGHM和IGHG基因重链(CH1)恒定区1扩增VH序列(补充表S1)。

通过添加适配器和样品特异性条形码，在MiSeq Illumina平台(2×300 bp)上制备生成的VH扩增子进行多重测序。

对于未治疗的小鼠，从三种组织类型中分离出B细胞，并进行与治疗小鼠相同的处理。值得注意的是，目前实验设计背后的一般概念是允许免疫系统有足够的时间产生各种各样的B细胞，包括记忆细胞和浆细胞。虽然大多数小鼠的疫苗接种方案持续超过4周，但受到坏死过程和自发诱导淋巴结和肺转移的限制。

对所有4只小鼠组织中的B细胞进行BCR-Seq，共获得5.3×10⁷序列。使用MiXCR(37)对VH序列进行配对端对齐，并与参考种系比对，如在免疫遗传学服务器[IMGT(36)]中发现的，获得包括框架(FRs)、CDRs和全长VDJ区域在内的区域的注释。在建立抗体序列数据集用于生成库测量之前，根据选定的标准对筛选对齐的VH序列(见方法)(图1B)。

为了减少PCR扩增和测序过程中引入的错误，作者对每个样本的技术副本进行了BCR-Seq。

为了估计测序深度是否足够，对每个样本的BCR-Seq数据进行了稀释曲线(生态学中常用的量化物种多样性的方法)。当对单个重复进行稀疏分析时，发现稀释曲线并不趋向于渐近线(图2)

这意味着序列深度的持续增加增加了独特的VH序列多样性。这可能是由于在BCR-Seq过程中不断引入的误差，所以无法达到稀释曲线的饱和。

相比之下，使用技术重复方法，VH序列的稀释曲线(在两个重复之间共享)确实饱和，从而表明测序深度确实足够，并且从数据集中充分消除了错误(图2B, C)。

随后对BCR-Seq重复序列进行Spearman秩序相关分析，发现存在唯一抗体VH序列频率和重复序列之间具有相关性。

对来自所有组织的重复序列之间共享的验证序列进行稀释曲线分析，表明曲线达到渐近线，60-80%的reads占样本中可能多样性的99%(图2F)。

因此，表明，技术重复方法在降低BCR-Seq期间引入的错误率方面是有效的，并且在高再现性的情况下达到了足够的测序覆盖率。

为了确定B细胞在所有组织中的克隆性，基于相同的V和J基因片段以及CDRH3区域100%的同源性(核苷酸同源性)将B细胞聚集在一起。

从克隆极化和克隆多样性两个参数描述了B细胞的克隆结构。对于第一个参数，高克隆极化被定义为少数B细胞克隆在特定样品中贡献了绝大多数VH序列读取的状态(图3A)。

因此，为了量化每个组织中的克隆极化水平，作者计算了在特定组织中产生80% VH序列读取的B细胞克隆的数量。结果发现，在TME中，平均有20种肿瘤内免疫球蛋白克隆型主导B细胞反应，而在其他组织中，贡献80% reads的克隆数量比TME高2-3个数量级(图3B)。

计算的第二个参数是克隆多样性，它反映了每个组织中存在的唯一B细胞克隆的数量。该参数可用作指示性度量，以确定响应的性质是寡克隆还是多克隆。Hill多样性(41)表明肿瘤中的克隆多样性明显低于其他组织中的克隆多样性，这一发现与克隆极化的数据一致(图3C)。

TIL-B反应的低多样性和高极化水平表明，在作者的TNBC模型中，肿瘤组织内发生了B细胞克隆增殖。正如预期的那样，靠近原发肿瘤的DLNs中的B细胞反应也表现出高克隆极化水平(与“naïve”淋巴结相比)(图3B)和低Hill多样性(图3C)。

然后，作者分析了CDRH3的长度分布，作为肿瘤或邻近 DLNs中可能发生的阳性克隆选择过程的指示性测量。TIL-B克隆的CDRH3平均长度明显长于naïve小鼠骨髓中B细胞克隆的CDRH3长度。在DLN衍生的B细胞中观察到CDRH3长度的相同偏差(图3D)。

抗体库可以根据其使用基因片段的频率来描述[V(D)J]，特别是V基因片段，因为它是最长和最多样化的片段(42)。V基因在naïve B细胞亚群中的使用是由半随机过程决定的，导致V-D-J片段在基因重排过程中作为B细胞发育的一部分而关联(43)。因此，假设V基因使用从naïve小鼠骨髓中分离的IgM⁺ B细胞可用于确定“基础”V基因的使用，如前所述(44)。根据下降频率与“基础”V基因使用频率对所有组织中的V基因使用进行分类。发现TIL-B和DLN克隆中的V基因使用特征与“基础”特征有很大不同(图3E和补充图S3)。这种V基因使用的改变可以被认为是遇到抗原后发生的克隆选择过程的一个指标。

数据显示，在naïve和处理过的小鼠中，IgM是骨髓B细胞的主要同型，而一小部分B细胞是IgG⁺ (75% IgM和20% IgG，图4A)。

在分析来自血液的小鼠B细胞时观察到类似的分布;在所有小鼠中，无论治疗或未治疗，优势同型均为IgM(96%)，反映了naïve B细胞或非CSR记忆B细胞编码的抗体(图4A)。

正如预期的那样，治疗小鼠DLNs中B细胞编码的IgG/IgM比值高于naïve小鼠淋巴结中的IgG/IgM比值。最后，TIL-Bs 主要以IgM为主，IgG其次(图4A)。

为了进一步探索指示B细胞激活状态的库测量值，作者分析了不同同种型的每个组织中的SHM率。发现TIL-B室的SHM率(12个突变的平均值)显著高于DLNs、骨髓和血液。令人意外的是，在SHM率很高同时TIL-Bs却是以IgM为主的。

为了进一步研究这一观察结果，作者比较了所有组织中同种异型的SHM率。正如预期的那样，IgG⁺ B细胞的SHM率明显高于IgM⁺ B细胞，因为IgG⁺ B细胞被认为是活化的B细胞，因此已经经历了亲和成熟和CSR过程。此外，通过检测IgG⁺ B细胞亚群中的SHM率分布，作者发现了不同水平的SHM，代表了处于不同亲和力成熟阶段的B细胞(图4C)

对IgM⁺ B细胞中SHM率分布的进一步检查显示，除肿瘤外，所有组织中SHM率分布为单峰分布(单个优势峰)，肿瘤中SHM率分布为双峰分布(一个峰低SHM率，另一个峰高SHM率，图4C)。

IgM⁺ TIL-B亚群中的第二个峰(图4C中用圆圈突出显示)代表经历了亲和成熟但没有CSR的B细胞。对于这个特殊的观察结果，一个可能的解释是，在TIL-Bs有足够的时间完成CSR过程之前就获取了它们。另一种可能的解释是，由于TME的致瘤活性，CSR信号受损。

作者在肿瘤中平均鉴定出1250个B细胞克隆，而其他组织中B细胞克隆的数量更高(DLNs=4700，血液=5550，骨髓=12110）。为了追踪TIL-B克隆在DLNs、血液和骨髓中的分布，作者确定了肿瘤和其他三种组织类型中的任何一种的共享克隆。因此，作者将出现在肿瘤和至少一个附加组织中的克隆定义为普通克隆，并检查它们在每个组织中的频率(图5A;有关常见克隆数目的详情载于补充表S4)

为了确定在这些普通克隆中是否存在过多的V基因，在naïve组织中观察到的半随机V基因使用与在普通克隆型中观察到的V基因使用的比较(图5B)显示，13个V基因在治疗小鼠中显着过度表达，其中8个V基因在至少两只小鼠中是共同的。在3只小鼠中，IGHV3-1、IGHV1-7和IGHV2-2 V基因被过度表达。这些过度代表的V基因可能表明，由于与肿瘤或TME中的TAAs接触，在普通克隆中可能发生了趋同过程。在此基础上进行了分析，在至少3只小鼠的共同克隆中，发现4个V基因显着被低估(IGHV7-1、IGHV5-6、IGHV1-9和IGHV5-2)。

此外，作者还研究了在共同克隆中SHM模式是否更偏向于沿着VH区域（FR和CDR）引入。正如预期的那样，与相邻的FR相比，CDRH1-2表现出更高的SHM速率（图5C）。

接下来，为了探究在普通克隆中与naïve小鼠中鉴定的所有克隆中是否偏斜，作者检查了CDRH3长度的分布(图5D)。虽然普通克隆和naïve克隆的CDRH3长度中位数均为13 AA (n = 930, n = 11995)，但普通克隆型的CDRH3长度分布确实表现出与naïve B细胞不同的分布模式。

最后，小鼠产生四种IgG亚类，即IgG1、IgG2A、IgG2B和IgG3。具体来说，有研究表明，IgG1/IgG2A频率比低反映了Th1应答高于Th2应答。IgG1的产生在Th2细胞因子IL-4的作用下升高，IgG2A的产生在Th1细胞因子IFN-g的作用下升高(45,46)。为了检查在普通克隆中发现的IgG1与IgG2A频率比率的任何变化，我们计算了naïve小鼠骨髓、血液和淋巴结中B细胞中的IgG1/IgG2A比率，并将其与肿瘤小鼠(即肿瘤和骨髓、血液或DLN共有的克隆)中上述每种组织类型的肿瘤常见克隆中的比率进行了比较。作者发现，普通克隆中的IgG1/Ig2A比例平均比naïve小鼠中的比例低两倍(补充图S4)。

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