T/B细胞受体（TCR/BCR）作为T/B细胞的独特“分子标签”，可以反映适应性免疫系统的深度和广度。通过TCR/BCR二代测序（NGS）技术可以捕获大量免疫组信息，从而帮助我们在免疫介导的相关疾病领域中探索发病机制、寻找生物标志物和治疗靶点、疗效监测以及判断预后等。
自身免疫性疾病与适应性免疫系统存在密切的关系，T/B细胞的活化在自免疾病的发病机制中起着关键作用。因此TCR/BCR NGS技术在自免疾病研究中具有广泛潜力，有助于深入理解疾病机制、发现新的治疗靶点以及开发个性化的治疗方案。本文分享几篇免疫组测序应用于自身免疫性疾病研究的高分文章，供大家开拓思路。
文献一
标题：天疱疮慢性水疱中克隆性CXCL13+CD4+T细胞和Tregs的微环境网络
发表期刊：Journal Of Clinical Investigation
影响因子：13.3
发表时间：2023年12月
作者研究了三级淋巴结构（TLS）在天疱疮发病机制中的作用。采集天疱疮（Pemphigus）患者带有慢性水泡的皮肤组织样本，
通过免疫荧光染色、bulk和单细胞RNA-Seq及TCR-Seq以及高度多重成像技术等分析皮肤的免疫学特性。通过高频TCR克隆分布、共享克隆分析、治疗前后克隆变化等角度揭示皮肤病变TLS中的TCR克隆特征和皮肤局部治疗的疗效。
研究结果
CD4+T细胞是皮肤TLS中产生CXCL13的主要细胞
CXCL13是一种免疫细胞趋化因子，通过免疫荧光研究发现CXCL13+细胞主要位于TLS中。然后使用各种细胞标记物确定了大多数CXCL13+细胞是CD4+T细胞。通过bulk TCRβ 测序评估TCR克隆在皮肤病变TLS中的分布，TOP10克隆占 TCRβ总库的50%以上（图1），表明部分T细胞被激活。
图1
具有Th1样特征的CXCL13+CD4+T细胞被激活
对来自4个至少持续1年的慢性皮肤病变的样本进行了单细胞RNA-Seq（scRNA-Seq）联合单细胞TCR测序（scTCR-Seq）。在具有TLS的皮肤病变中观察到6个TCRβ T细胞簇（图2B-C），两个活化的CD4+T细胞簇（簇1和5）TCR共享程度最高（图2D），簇5比簇1克隆性更强（图2E）。
天疱疮是由靶向桥粒芯糖蛋白1（DSG1）和/或 DSG3的自身反应性免疫细胞介导的，为了确定这些簇是否具有DSG特异性自身反应性T细胞，作者鉴定了1名天疱疮患者的PBMC中DSG3反应性、激活诱导的标记物CD4+T细胞中的TCR库，并将其克隆结果与同一患者的scTCR-Seq的TCR库相匹配。作者发现DSG特异性非循环Tfh（非cTfh）记忆CD4 T细胞位于簇1和5中（图2F），且这两个活化的CD4+T细胞群是克隆扩增的。然后比较了这两个细胞群的基因表达，发现克隆扩增的CXCL13+CD4+T 细胞具有Th1样细胞的特征。
图2
局部治疗可有效控制天疱疮患者皮肤TLS的慢性水疱
作者用病灶内皮质类固醇注射（ILI）治疗了18例患者。治疗后所有病灶均减少甚至完全清除。对三例患者ILI治疗前后进行TCR测序，治疗前病变中TOP10的TCR克隆在治疗后均消失（图3D）。表明皮质类固醇病灶内治疗可改善天疱疮的慢性水疱并减少皮肤TLS。
图3
小结
该研究证实了天疱疮中皮肤TLS的致病性，并为天疱疮慢性病变的局部治疗提供了重要证据。通过免疫组联合转录组测序，证明了CXCL13+CD4+T细胞的扩增和激活是TLS形成的重要驱动因素，该研究结果可能有助于了解TLS在其他疾病中的发展。
文献二
标题：下一代测序揭示了自身免疫性肝炎的病理性T细胞结构
发表期刊：Hepatology
影响因子：17.298
发表时间：2021年4月
该研究应用NGS技术探索了自身免疫性肝炎（AIH）患者血液和肝脏组织的TRB和IGH库特征，发现抗原驱动的选择在T系中形成疾病特异性簇，而在B系中并不明显。
研究结果
AIH患者的TRB和IGH库免疫指标
对60例AIH患者及60例健康志愿者（HD）外周TRB和IGH进行测序，另外纳入30例原发性胆汁性胆管炎（PBC）患者和30例丙型肝炎病毒（HCV）患者作为额外的对照。还研究了12例AIH患者和6例非AIH患者的肝组织IGH和TRB库。
无论是外周血还是肝组织层面，AIH与健康或疾病对照的免疫指标（平均丰度、克隆性、香农指数、SHM率）都没有明显区别。但是发现AIH患者的肝组织TRB库克隆性有更高的趋势（图1）。
图1
TRBV-J基因使用存在AIH特异性偏倚
PCA分析显示，与健康对照组相比，三个疾病组的TRBV-J基因使用均存在明显偏倚，而IGHV-J基因使用偏倚程度较小（图2A）。疾病组之间的比较也显示出TRBV-J使用的显著差异，说明观察到的T细胞偏斜是疾病特异性的。与AIH和HCV相比，AIH和PBC显示出更相似的T细胞库（图2B）。肝组织层面，与对照组相比，AIH的T细胞库也显示出偏斜，但可能因为样本缺乏的原因，当考虑PCA所有维度时未观察到明显偏斜（图2C）。
图2
另外，作者发现TRBV6和TRBV20家族基因的使用差异代表了粘膜相关不变T （MAIT）细胞的关键特征（图3A）。且免疫抑制治疗后疾病的完全缓解对AIH患者的T细胞结构偏倚没有影响（图3B）。
图3
GLIPH分析揭示了与AIH相关的肝组织T细胞簇
AIH肝脏和对照肝脏之间的克隆分布相似（图4A），表明AIH肝脏T细胞结构的特征是抗原反应性T细胞的多样性，而不是单个反应性T细胞克隆的扩增。作者使用GLIPH算法来聚类共享抗原特异性的TCR。这项分析揭示了一组595个T细胞簇，它们只存在于AIH患者的肝脏中，而在对照组样本中只检测到203个T细胞簇（图4B）。最富集的AIH T细胞簇表现出共同的CDR3基序，在4例血液样本匹配的病例中，作者发现外周T细胞在活动性疾病的时间点也表现出这些CDR3基序，表明这些基序也可能被外周追踪（图4C）。
图4
小结
该研究发现自身免疫性肝炎患者表现出深刻且持久的T 细胞结构变化，不受免疫抑制治疗的影响，与疾病缓解无关。这可能解释了逐渐减弱免疫抑制后的高复发率。
文献三
标题：以趋化和炎症为特征的新型CD4+CTL亚型参与了Graves眼病的发病机制
发表期刊：Cellular & Molecular Immunology
影响因子：21.8
发表时间：2021年1月
为了探索驱动Graves眼眶病（GO）进展的致病性CD4+T细胞类型，作者应用了单细胞RNA测序（scRNA-Seq）、T细胞受体测序（TCR-Seq）、流式细胞术、免疫荧光和混合淋巴细胞反应 （MLR）测定来评估来自GO和甲状腺功能亢进症（GH）患者的CD4+T细胞。鉴定出了一种具有趋化性和炎症特性的新型CD4+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）亚型，该CD4+CTL的细胞毒性和趋化性水平升高可能与GO复发相关。通过TCR-Seq证明了GO患者中该CD4+CTL细胞表现出明显的克隆扩增。
研究结果
GO中的CD4+KLRG1+CTLs表现出明显的克隆扩增
CD4+KLRG1+CTL是鉴定出的新型CD4+CTL亚型。对GO患者的循环CD4+KLRG1+CTL进行了TCR测序。与幼稚CD4+T细胞相比，CD4+KLRG1+T细胞的多样性和均匀性显着降低（图a、b）。以GO11和GO13样本为例，可以看到TOP1的V-J基因组合频率高达11.13%和34.06%（图c）。某些CD4+KLRG1+T细胞克隆的扩增可能是对自身抗原暴露的特异性免疫反应。另外作者分析了7个GO样本中CD4+KLRG1+CTL和幼稚CD4+T细胞各自的TCR克隆型的重叠，CD4+CTL之间仅共享3个克隆型，而有178个克隆型在幼稚CD4+T细胞中共享（图d），说明CD4+CTL在患者中具有异质性。
小结
该研究证明了具有趋化性和炎症特征的新型CD4+CTL亚型对GO具有特异性，为CD4+CTL在GO中的致病作用提供了强有力的证据。这种新型促炎CD4+CTL亚型与GO的发病机制有关，值得作为未来的新治疗靶点进行探索。
参考文献
(1) Han D, Lee AY, Kim T, et, al. Microenvironmental network of clonal CXCL13+CD4+ T cells and Tregs in pemphigus chronic blisters. J Clin Invest. 2023 Dec 1;133(23):e166357.
(2) Schultheiß C, Simnica D, Willscher E, et, al. Next-Generation Immunosequencing Reveals Pathological T-Cell Architecture in Autoimmune Hepatitis. Hepatology. 2021 Apr;73(4):1436-1448.
(3) Wang Y, Chen Z, Wang T, et, al. A novel CD4+ CTL subtype characterized by chemotaxis and inflammation is involved in the pathogenesis of Graves’ orbitopathy. Cell Mol Immunol. 2021 Mar;18(3):735-745.
以上几篇文章充分展示了免疫组测序如何在自免疾病发病机制及治疗靶点的研究中发挥重要作用，更多与适应性免疫相关的疾病有待进一步探索。之后我们也会继续分享免疫组测序相关高分文章，敬请期待！