中药是传统中医的瑰宝，在漫漫历史长河中发挥了不可替代的作用，然而中药调节免疫功能的复杂机制仍有待深度探索。浙江大学药学院联合浙江寿仙谷植物药研究院发表了题为”Protective effects of Ganoderma lucidum spores on estradiol benzoate-induced TEC apoptosis and compromised double-positive thymocyte development”的文章，从细胞、蛋白、基因等多个层面探讨了灵芝孢子调节改善免疫功能的作用机制。
该研究采用了艾沐蒽ImmuHub®TCR测序分析系统，探索了灵芝孢子对胸腺T细胞发育过程中TCR重排的影响。
题目：灵芝孢子对苯甲酸雌二醇诱导的TEC细胞凋亡和双阳性胸腺细胞发育抑制的保护作用
发表时间：2024年8月16日
发表期刊：Frontiers in Pharmacology
影响因子：4.4
本研究构建了苯甲酸雌二醇（EB）诱导的胸腺萎缩小鼠模型，然后采用多组学技术来阐明灵芝孢子（GLS）如何调节T细胞发育，并评价了GLS对胸腺萎缩的改善效果。
研究结果
GLS减轻EB诱导的胸腺T细胞发育损伤
将小鼠分为con组（生理盐水）、EB组、BGLS（子孢层断裂的GLS）组、RGLS（去除孢子胚层的GLS）组等多个治疗组，作者通过疗效评价实验、组织学评估、血液T细胞亚型比例变化等方面证明了GLS减轻了EB诱导的胸腺T细胞发育损伤，并增加了外周血中CD4 T细胞的比例，其中RGLS显示出比BGLS更明显的效果。
RGLSH抑制EB诱导的TECs细胞凋亡
采用蛋白质组学分析胸腺组织中的蛋白质变化，发现RGLSH（Ubenimex+高剂量RGLS）可以增强胸腺上皮细胞（TEC）中的蛋白质合成、RNA剪接以及DNA复制和修复，从而促进细胞增殖和存活。另外，RGLSH显著下调EB诱导的细胞凋亡相关蛋白。
为了更好地反映RGLSH对TECs凋亡的保护作用，作者采用共定位免疫组化（IHC）检测RGLSH对CK8 TECs（cTECs）和CK5 TECs（mTECs）中Casp3蛋白表达水平的影响。与Con组相比，EB处理显著提高了CK8 cTECs和CK5 mTECs中 Casp3 蛋白的表达水平；而与EB组相比，RGLSH处理显著降低了Casp3蛋白的表达水平（图1B、D）。这些结果共同表明RGLSH改善EB诱导的TEC细胞凋亡。
RGLSH促进胸腺细胞从双阴性到双阳性的发育
为了评估 RGLSH 对减轻 EB 诱导的胸腺萎缩对胸腺细胞发育的影响，作者使用流式细胞术分析了不同阶段胸腺细胞的比例。EB 处理显着增加了双阴性（DN，CD4−CD8−）胸腺细胞的比例，降低了胸腺中双阳性（DP，CD4+CD8+）胸腺细胞的比例，表明EB抑制了胸腺细胞从 DN 到 DP 阶段的发育。相比之下，RGLSH 处理显著降低了DN。这表明 RGLSH 促进胸腺细胞从 DN 到 DP 阶段的发育，而不是停滞在 DP 阶段。
RGLSH增强DP重排
接下来作者进行了单细胞RNA测序（图2A）。基因特征分析显示 RGLSH 促进胸腺 T 细胞发育（图2B)。RGLSH 处理改变了 DN 和 DP 胸腺细胞的比例（图2C、D)，与流式结果相一致。DP胸腺细胞根据从早期到晚期的发育进展可进一步分为三个亚型：原始细胞增殖下的DP（DPblas）、重排下的 DP（DPres）和接受选择的DP（DPsels)（图2E-F）。RGLSH 处理增加了DPsels的比例，同时降低了DPblas的比例（图2G），这表明 RGLSH 有可能通过提高DP重排的效率将更多的 DPblas 转换为DPsels。
考虑到 DPres 胸腺细胞的分化从根本上说是 VJ TCR 片段重排形成成熟 TCRα 链的过程，作者进行了 TCRα 测序，以分析RGLSH对 DPres胸腺细胞 TCRα 链形成的影响（图3A)。EB和RGLSH均不影响 TCRα 链基因的多样性（图3B-C），然而，RGLSH 提高了克隆效率（图4D)和克隆性指数（图3E）。这些结果共同表明，RGLSH 促进胸腺细胞的DPblas-DPres-DPsels 发育轴。
RGLSH调节DP胸腺细胞的选择和耐受性
作者进行了基因特征分析并筛选了几种建立 CD4 T 细胞谱系的转录因子，它们被 EB 下调，但被 RGLSH 上调。自身免疫调节因子 （Aire）是一种关键的致耐受性转录因子，EB显著降低Aire表达，而RGLSH上调Aire表达。作者对胸腺组织中CK5和Aire进行了共定位IHC分析，发现RGLSH 通过上调mTECs中Aire的表达来促进胸腺细胞的负向选择。
RGLSH促进DPres胸腺细胞分化为iNKT细胞
作者确定了受RGLSH影响的TCRα链，重点关注基于克隆性指数的前五名，前5名集中在TRAV11-TRAJ18重排（图4F)。RGLSH减弱了EB对TCRα片段TRAV11和TRAJ18组合的抑制作用（图3G、H），包括组合频率和使用频率。既往研究发现了TRAV11-TRAJ18 TCRα链在不变的自然杀伤T细胞（iNKT）中一致表达。这表明RGLSH可能调节一定比例的DPres胸腺细胞进入DPsels阶段，最终分化为iNKT细胞。
然后作者根据每个细胞群的特异性标志物将DP胸腺细胞分为24个亚组，并预测胸腺细胞的分化轨迹。分析了三个CD4 SP细胞群中的两个iNKT细胞标志物CD24a和CD44，CD44的表达沿着DPsel-1→PDsel-4→DPsel-5→DPsel-6的发育轨迹逐渐升高，最后在 DPsel-7期降低。研究表明DPsel-7代表DPsel iNKT的终末期，其中标志物表达与 0 期 iNKT 的特征一致。RGLSH提高了几个细胞周期相关基因的表达水平。这些结果强调了RGLSH在调节DP胸腺细胞分化为 iNKT1细胞中的作用。
RGLSH限制DP胸腺细胞之间的pMHC-CD8通讯
与Con组相比，EB显著降低了DP-DP胸腺细胞相互作用的强度；而与EB相比，RGLSH处理在DP-DP胸腺细胞相互作用的强度上表现出上升趋势。CD1d 是一种在DP胸腺细胞中表达的非经典pMHC分子，是糖脂抗原的关键呈递基因。作者发现EB处理显著降低了CD1d 表达，而RGLSH处理增加了多个亚群的 CD1d表达。这表明RGLSH可能通过增强DP胸腺细胞中CD1d的表达来促进糖脂抗原的呈递。
然后作者深入研究了涉及DPsel-7胸腺细胞和DP胸腺细胞的配体-受体相互作用的类型。RGLSH 处理减轻了DPsel-7胸腺细胞和DP胸腺细胞之间的pMHCI-CD8相互作用。
这些结果表明RGLSH可能通过降低 pMHCI、pMHCI-CD8相互作用的表达和增加DP胸腺细胞中CD1d的表达来限制pMHC特异性选择并增强非肽特异性选择，从而促进iNKT细胞分化。
研究结论
该研究揭示了RGLSH如何影响从双阴性胸腺细胞到成熟T细胞的转变，RGLSH成为促进双阳性胸腺细胞发育为iNKT细胞的关键参与者。这种效应是通过在重排阶段增强TRAV11-TRAJ18 TCRα链的形成和在选择阶段限制DP胸腺细胞中的pMHC-CD8 相互作用来实现的。
灵芝孢子可有效缓解EB诱导的TEC细胞凋亡和双阳性胸腺细胞的发育抑制。该研究对灵芝孢子免疫调节作用的见解为其作为T 细胞再生诱导剂的潜力铺平了道路。
文献来源：Yang J, Pan H, Wang M, Li A, Zhang G, Fan X, Li Z. Protective effects of Ganoderma lucidum spores on estradiol benzoate-induced TEC apoptosis and compromised double-positive thymocyte development. Front Pharmacol. 2024 Aug 16;15:1419881. doi: 10.3389/fphar.2024.1419881.