艾沐蒽助力揭示衰老骨髓干细胞机制的新视角！Cellular & Molecular Immunology最新发表

2023年8月30日，艾沐蒽助力陆军军医大学在《细胞与分子免疫学》（Cellular & Molecular Immunology）（IF=24）上发表题为“衰老骨髓造血干细胞劫持调节性T细胞营造促其存活的微环境（Aged hematopoietic stem cells entrap regulatory T cells to create a prosurvival microenvironment）”的研究论文。研究使用艾沐蒽生物ImmuHub® TCR分析系统，研究解析了电离辐射致骨髓造血远期损害的效应与机制，拓展了衰老造血干细胞(HSCs)存活及优势扩增发生机制的认识，为电离辐射致骨髓造血远期损害的防治提供了新思路。

下面就让我们一起了解一下！

       组织驻留体细胞稳态的解除被认为是衰老过程的关键因素，造血干细胞(HSCs)的衰老支撑着系统器官有限的健康跨度，造血干细胞是研究干细胞衰老的一个很好的范例。HSC老化的特征是重构能力降低、骨髓偏向性HSCs扩大、复制应激增加、DNA突变积累、细胞凋亡抵抗能力增强、自噬能力丧失以及表观遗传、转录和翻译改变。然而，HSC老化这些特征的机制相互关系和等级顺序尚未明确。特别是，引起HSC衰老的起始事件的性质和时间在很大程度上仍然未知，因此无法从早期预防HSC衰老。

       该研究使用早衰和中年小鼠模型，发现并表征了BM Tregs在HSC衰老中的独特功能。研究发现，衰老HSCs中的DNA突变积累可诱导主要组织相容性复合体II类(MHCII)上调和BM Treg克隆扩增。此外，通过MHCII -T细胞受体(TCR)的参与，衰老HSCs与BM Tregs之间建立了双向相互作用，通过TCR识别衰老HSCs上的MHCII，BM Tregs得以扩展，而通过间隙连接(GJ)介导的BM Tregs中环磷酸腺苷(cAMP)的转移，衰老HSCs的凋亡启动得以减弱。重要的是，靶向HSC-Tregs相互作用可以防止HSC在早期衰老。

1. RNA-seq：在这项研究中，使用流式细胞术对于HSC和BM细胞进行细胞分选，从小鼠骨髓中分选造血干细胞和treg，提取RNA，进行RNA-seq。

2. TCRβ扩增和测序：TCRβ测序时，对BM Tregs进行分类，并提取RNA。随后，通过艾沐蒽生物 ImmuHub®技术对BM Tregs TCRβ链采用5 ‘ RACE法进行文库构建和高通量测序。

3. 全外显子组检测：将5只小鼠的骨髓造血干细胞进行分类汇总，提取基因组DNA进行深度WES检测。

01 HSC早期衰老伴随BM Treg克隆性扩增

       最初，作者采用了一种公认的小鼠早衰模型，将小鼠暴露于电离辐射(IR)中，这是一种众所周知的诱变剂。这与生理性造血老化类似，HSC老化的特征，包括扩张(图1A），重构能力受损(图1B)和骨髓偏向分化(图1C)是明显的，在IR (mpi)后3个月小鼠中明显可见，同时BM细胞数量适度增加(补充图1b)。在转录组水平上，与老年小鼠(18-24个月大)类似，IR小鼠的BM HSC表现出髓系偏倚(图1D)，并且使用aging signature(图1E)交叉验证了衰老特征，该特征提供了小鼠HSC衰老的全面转录组特征。令人惊讶的是，对于BM T细胞，作者观察到CD4⁺ T细胞在IR小鼠中扩增(图1F,G)。在CD4+T细胞中，除常规CD4+T细胞(Tconv)外，Foxp3+ Tregs的比例和数量在IR小鼠中显著增加(图F,G)。大多数位于外周组织的调节性T细胞是从胸腺输出的(称为tTreg)。这与生理性衰老类似，IR小鼠胸腺细胞，包括Treg数量，由于IR诱导的胸腺萎缩显著下降(图1H)。Treg的积累也可能源于Tconv的Treg表型转化(称为pTreg)或组织内Treg的局部扩增。根据使用这些pTreg生成的转录组数据，作者将pTreg特征叠加到火山图上，并将IR小鼠的BM Treg转录组与对照(Ctrl)小鼠的转录组进行比较，发现没有明显的Tconv-Treg表型转换迹象(图1I)。与脾Tregs (SP)和淋巴结Tregs (LN)相似，BM Tregs具有Helios^hiNrp-1^hi表型(图1J)，这被认为是区分tTregs和pTregs的一种表型。这些数据表明pTregs对IR后BM Treg扩张的贡献很小。TCR库显示IR小鼠中BM Tregs的克隆扩增(图1K, L)。此外，作者还发现IR小鼠的BM中Ki67⁺ Tregs的比例显著增加，而不是SP或LN(图1M)，反映了BM Tregs的特异性克隆增殖。

图1

02 MHCII-TCR参与触发老年HSC和BM treg之间的双向相互作用

       BM Tregs的克隆扩增表明，BM Tregs可能通过TCR识别BM驻留抗原呈递细胞(APCs)表面的MHCII呈递的同源抗原而被激活。实际上，通过RNA-seq观察到IR小鼠BM Tregs中TCR信号的显著激活(图2A)。通过分析了MHCII在骨髓中的专业APCs(包括Dc细胞、B细胞和巨噬细胞(MACs))以及最近被鉴定为熟练APCs的HSC上的表达。在IR小鼠的HSC中检测到MHCII而非MHCI的显著上调表达(图2B)。相应地，RNA-seq也揭示IR小鼠造血干细胞中MHCII介导的抗原呈递途径明显激活(图2A)。鉴于BM Tregs在人体和小鼠体内稳态时都定位于HSC附近，MHCII在IR小鼠的HSC上呈献同源抗原可能是BM Tregs克隆扩增的原因。为了支持这一发现，组织学分析显示，与对照组相比IR小鼠的造血干细胞，特别是MHCII⁺造血干细胞，比骨髓中的Tconv或CD8⁺T细胞更接近Treg（图2C-E），47.2%的造血干细胞与直接的Treg接触（在Treg10μm内）。根据MHCII的表达，作者将造血干细胞划分为MHCII^hi和MHCII^lo亚群（图2F）。作者发现，从1 mpi开始，MHCII^hi HSC的比例和数量逐渐急剧增加，而MHCII^lo HSC的比例急剧减少，尽管它们的数量只是轻微下降(图2G)。在与OTII naïve CD4⁺ T细胞共培养中，证实来自IR小鼠的MHCII^hi HSC比它们的MHCII^lo同类具有更强的抗原呈递能力。在体外，在MHCII^hi HSC与IR小鼠自体的BM Treg共培养系统中，观察到显著的Treg增殖，而通过Transwell室分离或用单克隆抗体(αMHCII)阻断MHCII显著地消除了增殖作用(图2H)。这些数据表明，TCR对IR小鼠造血干细胞上MHCII的识别刺激了BM Tregs的克隆扩增。

       主成分分析(PCA)显示，IR小鼠的MHCII^hi HSC与对照小鼠的MHCIIhi和MHCII^lo HSC存在很大差异，而IR小鼠的MHCII^lo HSC与对照小鼠的MHCII^hi和MHCII^lo HSC仅存在中度差异(图2I)。同时，IR小鼠的MHCII^hi HSC表现出更高的衰老特征等级评分(图2J)。这意味着MHCII上调可能标志着HSC过早衰老。为了支持这一发现，通过来自IR小鼠的MHCII^lo HSC相比，它们的MHCII^hi对应物在外周血(PB)和BM中都显示出明显较低的重建能力，并伴有更明显的骨髓偏倚(图2K)。然而，阻断MHCII或Transwell培养几乎可以消除这些影响(图2L)。在体内，Foxp3GFP-DTR小鼠的Treg消耗也显著挽救了MHCII^hi HSC的过度表达和HSC的老化表型(图2M, N），而不诱导Tconv和CD8⁺ T细胞的显著激活。过DT短期消耗Treg后Treg数量反弹在IR小鼠中仅部分发生，这可能是由于胸腺萎缩和激活的Tconvs缺乏Treg转化。特别是，相当比例的BM Tregs在稳态过程中定位于造血干细胞和CD8⁺ T细胞附近，CD8⁺ T细胞直接和/或间接调节正常和异常造血干细胞的维持。然而，CD8⁺ T细胞缺失对IR小鼠的HSC衰老表型或Treg缺失的治疗效果几乎没有影响。然而，BM Tregs的过继转移消除了这种拯救作用(图2M, N)。此外，转移的tregs占BM tregs的大部分，并且在受体IR小鼠中显示出显著的增殖(图2O)和在HSC生态位中的积累。总之，这些结果表明MHCII-TCR参与触发了衰老的HSC和BM treg之间的双向相互作用，这与驱动HSC衰老有关。

图2

03 DNA突变导致HSC MHC II上调

       通过观察到IR小鼠的MHCII^hi HSC比MHCII^lo HSC表现出更显著的突变负荷，这是通过全外显子组测序(WES；图3A, B)。然而，当Tregs被耗尽时，IR小鼠造血干细胞中的DNA突变负荷显著减少，而BM Tregs的继发性转移几乎消除了这种影响(图3C, D)。这些数据表明，突变积累可能通过产生MHCII限制性新抗原来促进IR小鼠HSC中MHCII的上调，抗原特异性Tregs可能促进这些突变积累的MHCII^hi HSC的存活。

图3

04 衰老HSC通过Cx43与BM treg建立功能性GJs

       接下来，作者试图确定MHCII^hi型HSC扩增的分子机制。首先分析了IPA对信号通路的最高富集，并注意到GJ信号在IR小鼠的BM HSC和Tregs中都被强烈上调(图4A)。据报道，MHCII-TCR的参与促进了T细胞和APC之间GJ的形成。实际上作者观察到，与IR小鼠的MHCII^hi型HSC相比，MHCII^hi型HSC中的GJ信号更加活跃(图4B)。GJ是由连接蛋白构建的(Cx)。其中，作者发现Cx43/GJA1在IR小鼠的HSC(尤其是MHCII^hi HSC)和treg中均显著且专一上调(图4C, D)。通过免疫染色，作者还经常观察到IR小鼠BM中HSC和treg之间可能形成基于Cx43的GJs(图4E)。在体外，通过钙黄蛋白(只能通过GJs在细胞之间转移)，作者验证了IR小鼠的HSC，特别是MHCII^hi HSC和treg之间建立了功能性GJs(图F, G)，并且这种作用是细胞接触和取决于MHCII(图4H)。当IR小鼠BM HSC与敲除Cx43的自体Tregs共培养时，钙黄蛋白转移几乎消失(Cx43^-/-；图4H）。同时，Cx43^-/- BM Tregs的过继转移与Cx43-精通的BM Tregs相比具有相似的免疫抑制和激活表型，未能逆转Treg耗尽和对HSC衰老的拯救作用(图4I,J)。这些结果表明，衰老的HSC和BM treg之间通过MHCII-TCR的作用建立了基于Cx43的GJs。

图4

05 BM treg通过GJs转移cAMP，减少衰老hsc的凋亡启动

       然后，通过研究老化HSC在用Tregs建立GJs时的结果。在最富集的信号通路中，作者注意到在IR小鼠的HSC中大量存在被抑制的凋亡信号(图4A)。此外，MHCII^hi型HSC中的凋亡信号比MHCII^lo型HSC中的更受抑制(图4B)，推断BM-Treg相互作用在HSC凋亡信号传导中发挥作用。为了支持这一发现，尽管IR小鼠MHCII^hi和MHCII^lo造血干细胞中凋亡细胞的比例在稳态下相当(补充图5a)，硼烷分析显示，IR小鼠对BIM（图5A）和BID的凋亡启动量远低于MHCII^lo。此外，造血干细胞，特别是MHCII^hi造血干细胞在IR小鼠中的抗凋亡能力是BM-Tregs依赖性的(图5B)。在体外，来自IR小鼠的MHCII^hi HSC的凋亡启动，而不是MHCII^lo HSC，在存在自体BM Tregs的情况下被减弱(图5C)，并且这种效应是细胞接触和MHCII依赖的(图5D)。值得注意的是，作者还观察到Cx43对于IR小鼠MHCII^hi HSC的体内抗凋亡是必不可少的(图5B)和离体(图5D)，表明GJs的参与。GJs通过小于1200da的可溶性因子的传递调节邻近细胞的胞内信号传导。RNA-seq显示，由次级信使cAMP激活的PKA信号在IR小鼠的BM HSCs和tregs中都被强烈激活(图4A)，并且在IR小鼠的MHCII^hi HSC中激活比MHCII^lo HSC中更明显(图4B)。与相关报道一致，作者也发现IR小鼠BM Tregs中cAMP水平的富集和显著升高(图5E)。cAMP-protein kinase A (PKA)信号正调控HSC存活，提示Tregs可能通过GJs将cAMP转移到衰老的HSC中，促进其存活。实际上，作者测量了IR小鼠MHCII^hi HSC中cAMP水平、PKA激酶活性及其下游CREB活性的显著增加(图F-H)，并且cAMP-PKA信号的过度激活依赖于BM Tregs中Cx43的表达(图5I)。然而，选择性抑制剂H89对PKA的抑制几乎消除了类似BM Tregs对IR小鼠MHCII^hi HSC的促存活作用(图5J)。为了进一步验证这一假设，作者使用Alexa Fluor 488标记的cAMP (488-cAMP)跟踪了cAMP的转移。如图所示，BM Tregs迅速而显著地将488-cAMP转移到IR小鼠的MHCII^hi HSC而不是MHCII^lo HSC(图5K)，并且这种作用依赖于细胞接触、MHCII和Cx43(图5L)。这些数据表明，BM Tregs通过GJs转移cAMP以减少衰老HSC的凋亡启动。

06 HSC-treg双向相互作用与HSC生理老化有关

       生理性HSC衰老的另一个特征是DNA突变积累，这种积累在中年很明显。有趣的是，HSC衰老表型(图6A)和BM Tregs的克隆扩增(图6B, C)从中年到老年水平已经很明显，伴随着DNA突变的急剧积累，特别是在MHCII^hi HSC中(图6D)。与IR小鼠类似，作者也发现了中年小鼠HSC室中MHCII^hi HSC的过度代表(图6E)。

       因此，与treg的独特邻接性(图6F, G)， GJ与Tregs的形成(图6H)和cAMP-PKA信号过度激活(图6I)，以及凋亡启动减少(图6J），在中年中年小鼠的造血干细胞中，特别是MHCII^hi中，观察到凋亡启动的减少。这些改变也在转录组学水平上得到了证实（图6K）。在转录组学和功能水平上，中年小鼠的MHCII^hi HSC表现出与老年小鼠相似的衰老特征和谱系偏差(图6L, M)。然而，Treg缺失显著减轻了中年小鼠的HSC衰老表型(图6N-P)，证明HSC-treg双向相互作用参与HSC生理性老化。

图6

07 通过干预老化HSC – treg相互作用预防HSC衰老

      最后，作者评估了研究结果的转化潜力。由于人源抗hCD25抗体(daclizumab)可获得并广泛应用于临床环境，作者首先测试了抗鼠CD25 (αCD25)在HSC衰老中消耗treg的治疗潜力(图7A)。αCD25给药显著减少IR小鼠中BM treg的数量，而不引起CD8⁺ T细胞的显著活化。同时，αCD25给药后，IR小鼠MHCII^hi HSC扩增明显减弱(图7B)，同时显著减轻了DNA突变负荷(图7C、D)，抑制了cAMP-PKA信号，增强了HSC的凋亡启动。

      最后，αCD25对IR小鼠HSC的衰老表型有明显的改善(图7E)。Gap27是一种肽，在体内已被证明适合干扰基于Cx43的GJs的形成和稳定性。在体外，作者证实Gap27有效阻断了GJ介导的cAMP在IR小鼠BM HSC和treg之间的转移。相应的，GAP27在体内显著缓解了造血干细胞cAMP-PKA信号的激活和凋亡抵抗，从而减轻了IR小鼠造血干细胞的衰老表型(图7B-E)。同样，给药αCD25或GAP27可显著挽救中年小鼠造血干细胞的早衰表型(图7F-J)。因此，系统给药αCD25或GAP27有望预防HSC衰老，至少部分干预了老化的HSC- treg相互作用。

图7 

图8

      BM Tregs在HSC衰老中的调节作用示意图（图8）特化骨髓(BM)微环境，称为HSC生态位，通过细胞结合或分泌因子或物理相互作用形式的细胞间信号维持HSC池的大小和功能。

      总之，本研究凸显免疫细胞及膜蛋白在HSC衰老中的关键作用，为实现提前预防和治疗HSC衰老提供了理论基础和新策略。未来通过系统阐明不同免疫细胞亚群与干细胞的互动，开发靶向干预HSC-Treg轴的新药物，有望抑制组织干细胞的加速衰老，延缓相关疾病的发生。