Immun-Cheq® | T细胞免疫测评应用于造血干细胞移植后的T细胞免疫重建评估

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造血干细胞移植（HSCT）已成为多种恶性血液肿瘤和骨髓衰竭性疾病有效且极具希望的治疗方式。其临床结果在很大程度上依赖于移植后造血功能的恢复和适应性免疫系统重建。

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一、造血干细胞移植

HSCT 治疗白血病的重要机制之一是供体免疫细胞识别白血病细胞表面抗原进行相应的免疫应答，攻击并清除宿主体内残留的白血病细胞，即移植物抗白血病效应(GVL)，这一效应与供体免疫细胞攻击宿主携带主要组织相容性抗原的组织器官所致的移植物抗宿主反应(  GVHR ) 有 密 切 关 系，GVHR 严重时将损伤正常组织器官，导致GVHD。而移植后白血病复发，提示白血病及其干细胞的生物学特性发生了重要改变或供体免疫细胞失能，不能有效攻击白血病(干)细胞，造成移植后 GVL 效应下降，即免疫逃逸。越来越多的研究提示，移植后骨髓局部免疫微环境重建情况对于造血功能重建和 GVL 效应发挥了重要作用。

众多研究者的临床实践提示，移植后的免疫重建对患者造血重建、平衡 GVHD 和 GVL 效应起至关重要的作用，并对患者的临床结局产生关键影响。
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二、造血重建和免疫重建规律

（一）造血重建
造血重建包括中性粒细胞和血小板的植入。
（二）免疫重建
1. 非特异性免疫重建：
除中性粒细胞外，非特异性免疫细胞包括NK细胞、单核细胞和树突状细胞（DC）。NK细胞是移植后最早重建的免疫细胞群，由于部分haplo-HSCT行T细胞去除处理，移植早期的抗肿瘤效应便依赖于NK细胞。NK细胞来源于造血祖细胞（HPC）的分化和成熟，在移植后1个月内数量恢复并发挥GVL效应，3～6个月内进行免疫表型和亚群比例调整。研究发现不同来源移植物均不影响移植后 NK 细胞恢复。单核细胞和 DC 数量通常在移植后30 d恢复，而单核细胞功能1年内是否恢复尚不明确。在allo-HSCT中，供者来源的DC可在2～6周后在外周血中取代患者 DC。总之，非特异性免疫细胞作为 allo-HSCT 后的早期免疫防线，对调节GVHD和GVL效应发挥重要作用。


2. 特异性免疫重建：
B细胞恢复通常来自供者HPC而非成熟 B 细胞扩增。在 HSCT 后 1.5～2 个月首先在外周血中检测到过渡型B细胞（CD19+CD24+CD38+），随成熟B细胞增多而数量减少。B细胞在6～12个月数量恢复正常，主要为过渡型和幼稚B细胞；在移植后2年B细胞功能仍受损及体液免疫缺陷。不同移植物来源的B细胞重建略有差异。
T细胞是完成免疫重建的最后一环，包括胸腺依赖性与非胸腺依赖性途径，由于移植前后胸腺损伤，因此移植后2年T细胞（尤其是CD4+T细胞）持续缺乏。与B细胞相反，早期T细胞重建依赖供者成熟T细胞的扩增，而T细胞的完整重建需依赖胸腺产生naïve T细胞分化发育。胸腺因预处理方案或 GVHD 而功能受损导致 CD4+T 细胞数目少，而记忆或效应型CD8+ T细胞移植后迅速扩增并在12个月内恢复正常，因此移植后CD4+∶CD8+ T细胞比值倒置是T细胞重建的最早特征之一并维持长达数年（主要取决于预处理方案及GVHD治疗方案）。脐血移植（UCBT）患者T细胞重建延迟6个月，在2年之后才能恢复。


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、

三、
衡量T细胞免疫重建指标

其中T细胞免疫重建是造血干细胞移植获得长期成功的一个关键因素。衡量造血干细胞移植后 T 细胞免疫重建的指标包括 T 细胞亚群的数量和比例、T 细胞受体(TCR)基因的多样性，以及胸腺近期输出功能的情况。

有关 T 细胞受体(TCR)基因的多样性和胸腺输出功能的检测，是目前最受关注的指标，也是国外多数研究中用于衡量造血干细胞移植后 T 细胞免疫重建的关键指标。


（一）移植后TCR多样性　

造血干细胞移植后功能性 T 细胞库的重建不仅仅在于外周 T 细胞数量和功能正常，而且还需要多样化的各TCR Vα 和 Vβ 亚家族 T 细胞谱系的恢复，不同亚家族和不同克隆 T 细胞因其表面所表达的TCR 的抗原识别区不同，所执行的功能也各异，这一多样性理论上可以高达1012，它是抵抗各种病原体和提高移植物抗肿瘤(GVT)或抗白血病(GVL)效应所必需的。以往评估各种移植后免疫功能重建情况主要通过 T 细胞总数、CD4 和CD8 分类及 CD4/ CD8 比值等。而NGS技术的发展使得能够TCR测序提供确切判断移植后免疫功能重建的量化分析方法。TCR测序结果可以获得大量的TCR信息，不仅能够分析其各 Vα 和 Vβ 亚家族的表达情况了解机体外周血中存在的各 Vα 和 VβT 细胞的分布和缺失情况；还能对各亚家族中 CDR3 的长度和序列分析，了解各亚家族中所包含的 T 细胞克隆数量。

TCR 是 T 细胞表面识别抗原的分子，也是 T 细胞产生免疫应答的第一个关键分子。TCR 有 α、β、γ和 δ四种肽链，以 α/β 和 γ/δ 两种异源二聚体分别表达于 T 细胞表面，外周血中主要以 αβ+T 细胞为主。每种 TCR链均由其相应的 TCR 基因重排而形成，TCR 基因由可变区(V)、多样区(D)，α 和 γ 基因无 D 区、结合区(J)和恒定区(C)4 部分基因片段组成。在 T 细胞发育过程中，TCR 基因的 V、(D)和 J 区发生基因重排，才能形成功能性 TCR，重排过程由于每种 TCR 具有大量的 V、(D)和 J 区，以及在各区联接之间有数量不等的核苷酸(N)插入，增加了其多样性，称互补决定区(CDR3)，CDR3 是抗原特异性识别结合的部位。由于不同克隆 T 细胞 TCR 基因所形成的 CDR3 的长度和碱基序列不相同，因此，分析各 TCR亚家族基因的 CDR3 谱型，可确定 T 细胞谱系的多样化。

（二）胸腺输出功能的检测

即通过了解胸腺在近期输出的初始(naive)T细胞的数量来表示胸腺的能力。目前认为：能够作为 naive T 细胞标志的是信号结合 T 细胞受体删除 DNA环(signaljoint T-cell receptor excision DNA circles, sjTRECs)，简称 TRECs。

TRECs 是 TCRα 基因重排前必须删除TCRδ 基因过程中的产物(因 TCRδ 基因座位于 TCRα 基因座中间)，它仍存在于细胞中，为游离基因，并不随T 细胞的进一步分裂而扩增，故随着 T 细胞的分裂而不断被稀释，因而外周血单个核细胞中TRECs 的含量基本上代表了 TCR 基因初始重排形成功能性 TCR 基因时的初始 T 细胞的含量，可作为胸腺近期输出功能的指标。

通过PCR定量分析样本中 TRECs 的数量，计算出一定单位数量 T 细胞中 TRECs 的水平，便可以了解其胸腺近期输出初始 T 细胞的数量，从而了解其胸腺的输出功能，即机体所具备的输出初始 T 细胞的后备力量。

美国Fred Hutchinson Cancer Research Center于2020年发表的一篇使用TCR多样性评估CBT后的预后文章 “ Impact of T Cell Repertoire Diversityon Mortality Following Cord BloodTransplantation ”。


脐带血移植(CBT)是使用脐带血作为造血干细胞的来源，与较低的移植物抗宿主病(GVHD)发生率相关，并为那些没有传统捐赠者的患者提供了解决方案。然而，由于免疫系统未能充分恢复，CBT在移植后一年内的致命性感染发生率较高。免疫细胞计数的定量测量可以预测CBT术后数年的生存率，但缺乏在移植后早期测量免疫恢复的方法。

T细胞是对抗感染的重要免疫效应器。在它们的成熟过程中，T细胞在编码T细胞受体(TCR)的基因中经历了DNA重排，这样每一个新生的T细胞都携带一个独特的TCR序列。这些独特的TCRs赋予每个T细胞识别和响应与外来入侵者相关的特定分子特征的能力。当T细胞分裂时，它的后代继承它的TCR序列，形成一个T细胞克隆。高通量测序技术允许科学家测量T细胞库的克隆多样性，这是跟踪T细胞反应的有效方法措施。Milano等人假设TCR多样性可以作为CBT后免疫恢复的功能测量，因为在外周血T细胞库重建过程中，系统的多样性依赖于TCR重排。

结论：


（1）在脐带血造血干细胞移植后的几个月里，T细胞的多样性开始逐渐回升。

（2）然而，即使CBT治疗一年后，T细胞的多样性也远远低于健康成年人的水平。



此外，经过CBT治疗后，TOP克隆随着时间变化会发生克隆频率下降或是消失，同时又有新的克隆出现。而健康对照组的TOP T细胞克隆随着时间的推移基本保持稳定。


（3）TCR多样性预测临床预后（死亡率）

幸存过一年的患者在CBT治疗后大约一个月开始出现TCR多样性恢复，而死亡的患者的TCR多样性继续下降，在100天时明显变小。

死亡患者存活中位时长216天，这表明在第100天的TCR多样性可以为实施潜在的临床干预措施提供充分的时间。

（4）T淋巴细胞的总数不能预测患者的多样性水平，在存活者和非存活者之间也没有差异。


（5）TREC水平在不同患者之间存在很大差异。无论是存活的患者还是死亡的患者，TREC的平均水平最初都非常低(数据未显示)。TREC水平在死亡患者中随时间下降，但在存活患者中恢复，这与已知的胸腺重建在免疫恢复中发挥的重要作用一致。

但由于患者之间存在差异，即使幸存者的TREC也恢复较晚，所以TREC值也不能预测患者移植后第一年的临床预后结果。

直接测量造血恢复很容易通过获得全血细胞计数来完成，测量TRECs足以评估移植后第一年的造血重建。然而，缺乏早期免疫系统恢复的直接测量，特别是相对于T细胞数量而言，T细胞功能方面的恢复。通过TCR测序反映TCR多样性水平可反映T细胞功能恢复情况。

综上，在接受CBT的患者中，如果在移植后几个月TCR多样性水平较低，可能是帮助提醒临床医生免疫恢复失败和需要额外治疗干预的重要措施。

此外，PY Yew等人发现移植后早期TCR高多样性可能意味着GVHD和HSCT移植后复发的风险都较低。Linde Dekker等人发现移植后患者总体生存和无事件生存不仅需要免疫细胞的快速免疫恢复，而且免疫恢复需要TCR多样化和平衡，以实现内环境平衡，防止免疫失调。

艾沐蒽生物于2020年发表题为“Quantitative Analysis of Thymus-Independent Donor-Derived T Cell Expansion in Transplant Patients ”论文，评估HSCT后的TCR免疫重建与GVT效应。我们引入了一个全新的指数TCRI（T细胞反应指数）， TCRI200bc≥1.0可提示患者存在有效的GvT效应，预示一年内无复发的可能性。（选中可链接此文详情）

综上，在造血干细胞移植后，通过TCR测序能评估T细胞免疫重建状态，移植后早期呈现高多样性的TCR能够应对潜在的高度多样性的非自身抗原，且GVHD和HSCT移植后复发的风险较低，据此能帮助提醒临床医生了解患者免疫恢复情况以及调整额外治疗策略提供参考。


Immun-Cheq®| T 细胞免疫测评

是艾沐蒽生物开发的基于免疫组NGS技术平台，对造血干细胞移植后患者血液中的T细胞进行TCR测序分析，通过分析T细胞免疫多样性、免疫系统储备、免疫年龄以及免疫应激状况来评估HSCT后患者免疫系统重建和免疫功能情况。


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参考文献：

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