近年来，国内外免疫治疗发展迅猛，被认为是继手术、放射治疗、化学治疗之后，对肿瘤有明确效果的又一重要治疗方法，广泛应用于多种恶性肿瘤的治疗，比如CAR-T、TCR-T等工程化T细胞免疫疗法已被证明对某些癌种具有良好的效果。但是因缺乏肿瘤特异性，目前的免疫疗法有待进一步探索和研究，以增强治疗效果。艾沐蒽在免疫驱动医学领域深耕多年，可在该领域研究中提供独特的技术优势。 2024年4月15日浙江大学医学院附属第一医院黄河院长团队在cancer innovation杂志发表题为“Establishment of a humanized mouse model using steady‐state peripheral blood‐derived hematopoietic stem and progenitor cells facilitates screening of cancer‐targeted T‐cell repertoires”的文章，该研究提出了一种新颖策略，利用具有个体特异性免疫指纹的人源化小鼠模型来筛选靶向癌症的TCR-T细胞，为设计患者特异性适应性免疫疗法提供了新的思路。文中使用艾沐蒽的ImmuHub®TCR检测系统，探索了人源化小鼠模型免疫刺激条件下的免疫特征。
1、收集人类外周血淋巴细胞，在三维培养系统中扩增出循环造血干细胞和祖细胞（cHSPCs）。 2、将扩增后的细胞应用于构建人源化小鼠模型，使小鼠体内拥有人类免疫系统的特性。 3、将两种不同的肿瘤细胞系（B细胞前体白血病细胞系和三阴性乳腺癌细胞系）注入人源化小鼠体内，通过流式细胞术检测不同时间点的人类免疫细胞类型，包括树突状细胞（DC）、单核细胞和T细胞等。 4、对分离的人类T细胞受体（TCR）β链进行高通量测序和分析。
图1.实验设计 通过细胞因子分泌动力学分析证明了人源化小鼠模型的成功建立和免疫激活后，作者通过DC细胞、单核细胞和T细胞来分析癌细胞输注后的免疫应激反应。通过流式细胞分析发现，CD14单核细胞对免疫刺激反应强烈，而髓系DC细胞（mDCs）和浆细胞样DC细胞（pDCs）在第一次输注后受到抑制，各种人类T细胞亚群在刺激后表现出不同的动态变化。这些数据进而揭示了免疫系统对人源化小鼠非活性癌细胞治疗的积极反应。 作者建立了两组人源化小鼠模型，雌性#1组和雄性#2组，每组进一步分为接受非活性癌细胞输注的处理组和未接受输注的未处理组。 未处理组的克隆counts数和独特CDR3核酸序列数量均高于处理组，无论是#1组还是#2组（图2a-d）。使用InvSimpson指数评估TCR库多样性，该指数侧重于反映高频克隆的多样性，处理组的多样性明显高于未处理组（图2e、f）。
图2 癌细胞刺激后VJ基因使用情况也发生了变化（图3g-o）。处理组的VJ基因及组合使用情况相似，表明对相同抗原的反应相似。另外处理组中检测到了未处理组中没有的新型VJ基因及组合（如TRBV5-3、TRBV1、TRB5-3-TRBJ2-1），这可能是免疫细胞反应的结果。这对设计针对特定肿瘤的工程化T细胞具有重要意义，尤其是涉及特定V-J使用模式的扩大化TRB V-J重排片段。
图3 克隆overlap分析显示，未处理组小鼠样本间相似度高于同一供体来源样本，而处理组之间差异显著（图4a），表明癌细胞刺激显著影响了克隆型范围，导致TCR-T细胞多样性增加。 作者进一步进行了共享克隆型分析，以鉴定通过体内自然反应机制产生的癌症反应性TCR-T细胞。各组之间有11个重叠的克隆型（图4b）。 各组之间只有低频重叠，表明癌细胞刺激对TCR-T细胞的多样性有相当大的影响。该策略提供了筛选关键癌症反应性TRB CDR3序列的机会，然后可以将其应用于工程化T细胞作为CAR-T细胞的设计。 另外通过对前15-20个高频重叠克隆型进行分析，作者揭示了癌细胞刺激后常见的TRB谱。两组人源化小鼠刺激前后的高频共享克隆的频率发生了很大变化（图4c，d）。一些克隆在处理后富集，这意味着刺激导致宿主出现T细胞反应。
图4 追溯处理组的TOP50克隆在未处理组样本中的频率分布，发现这些克隆在未处理组中频率较低或检测不到（图5a），表明癌细胞输注刺激产生了新的T细胞克隆型，并进一步促进了它们的优先扩增，因此成为处理组中的优势克隆。图5b的蜗牛图也说明了癌细胞输注后原本的优势克隆扩增程度增强或出现了新的优势克隆。TOP10克隆的频率占总频率的50%以上（图6c）。
图6 CDR3核苷酸长度范围呈正态分布（高斯分布）（图7a），在所有组中范围均在35bp至45bp之间。还观察到高斯CDR3氨基酸长度分布模式，CDR3区域的基序分析显示，T细胞的氨基酸使用不同，癌细胞刺激导致氨基酸使用的显着变化（图7b）。
图7 为了评估无活性癌细胞输注是否对肿瘤异种移植物的生长和小鼠的存活产生影响，研究人员向小鼠注射活的NAML-6-EGFP和MDA-MB-231-EGFP细胞，通过监测器官中EGFP表达来评估肿瘤负荷（图8a-c）。流式细胞术结果显示，未处理的人源化小鼠骨髓、肝脏和脾脏中肿瘤细胞比例高达10.51% ±1.67%，提示这些器官可能是肿瘤细胞存活的微环境。无活性癌细胞接种组小鼠中肿瘤细胞数量显著减少，暗示在人源化小鼠模型中，使用无活性癌细胞进行免疫接种可能有效抑制肿瘤生长。生存曲线分析（图8d）显示，经过免疫接种的人源化小鼠生存期显著延长，生存率高于对照组。
图8 本研究通过利用稳态外周血来源的cHSPCs建立人源化小鼠模型，为筛选针对癌症的TCR-T细胞库提供了新途径。基于高通量TCR测序，不仅在分子水平上鉴定了指向癌症抗原和克隆特征的可变序列，还鉴定了能够靶向癌细胞的癌症特异性TCR-T细胞。通过比较非活性癌细胞输注前后的CDR3序列，揭示了人源化小鼠中TCR-T细胞的多种序列变化和免疫学特征。这有助于设计个性化的工程T细胞，有望在癌症治疗中发挥重要作用。 杭州艾沐蒽生物科技有限公司成立于2016年，是国际前沿的专注于免疫驱动医学技术的国家高新技术企业。创始人团队来自美国芝加哥大学，在2010年开始使用免疫组基因高通量测序技术开展各种疾病相关研究，于2016年通过自主研发，全国首家推出NGS-MRD血液肿瘤微小残留病（MRD）检测Seq-MRD®，并授权泛生子使用。同时，公司拥有Immun-Traq®肿瘤治疗伴随诊断、Immun-Cheq® |T细胞免疫测评以及ImmuHub®免疫组测序科研服务产品，并布局有基于AI机器学习算法的T-classifier®肿瘤早筛、单细胞测序、TCR-T和抗体发现等平台管线。目前为止发表了数十篇论文，其中包括：Nature(IF:65), Signal Transduction and Targeted Therapy(IF:40), Cellular and Molecular Immunology(IF:24), Nature Communications (IF:17)等多篇高分杂志。公司构建几十项发明专利和软件著作权为核心的自主知识产权体系，为医院临床、生命科学研究、新药开发等提供解决方案和产品。艾沐蒽专注于通过解码适应性免疫系统来改变疾病的诊断和治疗，并致力于推进免疫驱动医学领域发展。