揭秘结直肠癌：T细胞、肠道微生物、体细胞突变的微妙关系

结直肠癌患者和健康个体在CDR3区域的Vβ和Jβ基因使用上存在差异

      作者通过高通量测序技术分析了30名健康供者和107名结直肠癌患者外周血样本中表达的TCRβ谱(表1)。

      每个健康供体或CRC患者在TCR多样性方面具有不同的特征。健康供体的TCR多样性相对较高，这可以从均匀分布的TCR Vβ-Jβ基因使用组合中看出(图1a显示了六个具有代表性的基因库);通过偏置的TCR Vβ-Jβ基因使用组合可以看出，结直肠癌患者的TCR多样性相对较低(图1b)。在48个功能性人类Vβ基因中，TRBV2的用法,TRBV3-1, TRBV5-1, TRBV5-4, TRBV5-5, TRBV5-6, TRBV6-1, TRBV6-5, TRBV6-6, TRBV7-6, TRBV7-7, TRBV7-8, TRBV7-9, TRBV10-1, TRBV10-2, TRBV11-1, TRBV11-2, TRBV12-3, TRBV12-4, TRBV15和TRBV29-1 CRC患者明显高于健康供者；健康供者中TRBV4-1、TRBV4-2、TRBV6-4、TRBV7-3、TRBV9、TRBV10-3、TRBV11-3、TRBV13、TRBV16、TRBV18、TRBV19、TRBV20-1、TRBV24-1、TRBV28、TRBV30的使用率显著高于结直肠癌患者(图1c)。对于功能性Jβ基因，TRBJ1-4在结直肠癌患者中的使用显著高于健康供者(图1d)。

图1

结直肠癌患者和健康供者TCR谱特异性序列特征

      本研究中，将TCR克隆的频率在样本中总读取量的0.5%以上定义为高扩增克隆(HEC)。比较CRC组和HC组之间的HEC数量，CRC组的HEC比率明显高于HC组(图2a)。这表明CRC患者的CDR3序列与HCs相比具有明显较多的克隆片段。作者通过使用TCR库重叠来评估两种不同样本的相似性，TCR库重叠定义为共享TCRβ序列的测序reads总数除以测序reads总数，范围为0 ~ 1。CRC组的TCR库重叠明显高于HC组(图2b)，这表明CRC患者与HC组相比具有相对较低的TCR多样性。TCRβ CDR3在健康供体和结直肠癌患者中的长度分布相似，在12个氨基酸处达到峰值(图2c)。但CRC患者的CDR3 aa长度为6、18和22比HC组少。

      随后，作者剔除HC组中出现的序列，并根据频率对剩余的CRC特异性CDR3序列进行排序(图2d)。直方图中为前50位的CRC特异性CDR3序列，表中为前10位的CRC特异性CDR3序列。为了进一步研究CRC和HC中CDR3序列的差异，取lg值创建总热图。发现大多数CRC和HC个体具有不同的CDR3序列，只有少数共同的序列(图2e)。

图2

结直肠癌患者的肠道微生物与HC个体有显著差异

      肠道微生物可以调节宿主免疫的关键位置。TCR测序分析可能是提示CRC患者肠道环境的发生显著变化，因此检测了肠道微生物组特征。通过收集了97例CRC患者和30例HC个体的粪便，并通过计量动力学技术检测了这些微生物（表2）。

      堆叠柱状图显示了CRC患者和HC个体中物种相对丰度前十位(图3a)。CRC组的Shannon指数显著高于对照组(图3b)。采用非度量多维尺度(nMDS)比较结直肠癌患者和肝癌患者之间的β距离。结果显示CRC组和HC组在nMDS1维度和nMDS2维度上存在显著差异(图3c)。LEfSe的高维比较进一步表明，在CRC患者中F.nucleatum，E.coli，Bacteroides thetaiotaomicron，Porphyromonas，Odoribacter splanchnicus，Prevotella，Vicia cryptic virus（VCV）和Dasheen mosaic virus （DsMV），而Lachnospiraceae，F. prausnitzii和R. intestinalis 在HC个体中明显更丰富（图3d-e）。EggNOG数据库是国际公认的专业同源聚类基因群注释数据库，包括原始的COG/KOG功能分类和基于分类学的功能注释。目前，该数据库(v4.5.1)包含190,000个同源分类群，涵盖2,031个物种。最丰富的KEGG同源物富集在碳水化合物代谢、氨基酸代谢、全局和概述图、膜转运和信号转导等途径中(图3f)。根据eggNOG/COG 注释，最丰富的NOG和最富集的GO项也是一个代谢过程。根据GO注释，生物过程类别中NOGs最丰富的是代谢过程、细胞过程和单个生物体;细胞成分类别中的细胞、细胞部分和膜;分子功能类别的催化活性和结合(图3g)。在前30个富集的GO功能中，主要富集的GO功能与生物过程(如异柠檬酸代谢过程、半乳糖酸代谢过程、d-半乳糖酸代谢过程和l-赖氨酸分解为乙酰辅酶a的过程)和分子功能(如切酶ABC活性、半乳糖酸分解代谢过程和d-半乳糖酸分解代谢过程)有关(图3h)。

图3

CRC相关的体细胞突变与TCR和肠道微生物有关

      为了探究基因变化是否介导结直肠癌患者微生物和免疫的巨大变化，并是否产生结直肠癌发生的相干信号，作者对79例结直肠癌患者癌组织和癌旁组织中的16个基因进行了全外显子组测序(表3)。

      每个样本中每个基因的突变信息以瀑布图表示，其中底部带有注释的各种颜色代表不同的突变类型(图4a)。在队列中，16个靶基因的体细胞突变比例由高到低依次为APC、KRAS、PIK3CA、GPT2、MSH2、MLH1、TP53、CTNNB1、AKT1、MMP2、NRAS、CD274、STK11、CTLA4、PARK7和SNCA。综上所述，这些突变进一步按照不同的类别进行分类，其中错义突变所占比例最大(图4b)，单核苷酸多态性的发生频率高于插入或缺失(图4b)， C>T是CRC中最常见的单核苷酸变异(SNV)(图4b)。此外，作者统计了每个样本中改变的碱基数量，并在箱形图中使用不同颜色说明突变类型(图4b)。在结直肠癌中排名前十的突变基因包括APC(52%)、PIK3CA(28%)、MLH1(20%)、CTNNB1(18%)、KRAS(32%)、GPT2(21%)、AKT1(14%)、TP53(20%)、MMP2(14%)和MSH2(21%)(图4b)。作者还发现F. nucleatum与GPT2呈显著正相关(P=0.004)， F. prausntzii与PIK3CA呈显著负相关(P=0.0119)(图4c)。GPT2与ASSIGGSSYNEQF(COR=0.45 p=0.0011)、ASSGETQY (COR=0.35 p=0.014)、ASSFNEQF (COR=0.35 p=0.014)显著相关。PIK3CA与ASSIGGSSYNEQF(COR=0.45 p=0.0011)、ASSGETQY (COR =0.35 p=0.014)、ASSFNEQF (COR=0.45 p=0.0011)也有显著相关性(图4d)。揭示了胶原蛋GPT2、PIK3CA的结构。

图4

建立基于肠道微生物群和TCR库区分CRC患者和HC个体的预测分类器

      生物标志物的筛选和获取作为最直接、最快速、最有效的诊断手段，在疾病预防、早期诊断、个体化治疗和预后评价等方面发挥着重要作用。通过合并微生物群和TCR信息表，共发现103份样本(73名结直肠癌患者和30名健康个体)同时包含TCR数据和微生物数据。然后，作者使用Wilcoxon秩和检验分析TCR数据与物种数据(物种水平)的差异，以P<0.05为阈值。使用算法从不同物种和TCR数据中选择合适的标记进行建模。使用随机森林(RF)算法对特征的重要性进行排序。

     通过对不同数量的特征进行建模，发现当选择以下15个特征时， 模型效果最好：     ‘ASSPSRQGTAEAF’，  ‘ATSDLAGDTDTQY’， ‘F.prausnitzii’，‘RPQGVPHSYNEQF’，‘SAKRREWQGRRGYT’，‘AWSPISGFENIQY’，‘ASSQERLTGVSPLH’，‘SVVVMLNYNEQF’， ‘R.intestinalis’，‘ASSQESTGNQPQH’，‘DsMV’，‘ASSHPREREDNYEQF’，‘ASSSGHYEQY’，‘SARGLAGNEQF’and ‘F. nucleatum’。以上15个指标的特征重要性排序系数值如图5a所示。由于样本数量相对较少，作者直接对训练模型的参数进行优化，并通过十倍交叉验证来检验模型的效果，以提高模型的准确性。选择随机森林算法构建的射频模型接收机工作特征(ROC)曲线如图5b、c所示。最终模型的效果可以通过曲线下面积(AUC)来评价。作者的CV AUC为0.92，训练AUC为0.99，训练准确率为0.95(图5b,c)。精度或AUC越高，效果越好。为了进行外部验证，通过收集了一个新的独立验证队列，包含46个样本，包括26例CRC患者和20例健康对照组（表4）。训练后的随机森林模型对验证的AUC 队列值为0.90（图5d)。

      根据CRC患者的TNM分期，I期和II期被认为是早期CRC, III期和IV期被认为是晚期CRC。生物标志物对健康个体早期CRC的诊断效果较好。训练和测试的AUC分别为98.99%和97.5%(图5e,f)。这些生物标志物也能很好地从健康个体中诊断晚期结直肠癌。训练和测试的AUC分别为99.22%和97.92%(图5g,h)。但生物标志物在区分结直肠癌的不同阶段表现稍差。训练和测试的AUC分别为87.5%和83.33%(图5i,j)。

图5

F. nucleatum-阳性和F. nucleatum-阴性结直肠癌患者外周血TCRβ表达谱的不同特征

      在研究中，来自LEfSe的高维比较表明，F. nucleatum在CRC患者中的代表性过高(图3e)。作者还发现F. nucleatum与GPT2呈显著正相关(P=0.004)(图4e)。此外，F. nucleatum是基于微生物组和TCR库的随机森林分类器的15个特征之一(图5a-c)。通过qPCR检测了大肠结直肠癌患者肠道肿瘤组织中F. nucleatum 的表达。为了确定F. nucleatum特异性TCR库特征，作者比较了F. nucleatum-阳性CRC患者(n = 22)和F. nucleatum-阴性CRC患者(n = 85)的TRBV和TRBJ基因的表达水平。TRBV7-3的使用在HC组高于CRC组，在F. nucleatum-阴性CRC组显著高于F. nucleatum-阳性CRC组；TRBV14在F. nucleatum-阳性CRC患者中的使用明显高于F. nucleatum-阴性CRC患者（图6a）对于功能性Jβ基因，TRBJ1-4和TRBJ2-2在F. nucleatum-阳性CRC患者中的使用显著高于F. nucleatum-阴性CRC患者(图6b)。TRBJ1-4的表达在CRC患者和F. nucleatum-阳性患者中均持续增加。TCRβ CDR3在F. nucleatum-阴性和F. nucleatum-阳性CRC患者中的长度分布相似，在12-氨基酸时达到峰值（图6c）。然而，与F. nucleatum-阴性的结直肠癌患者相比，F. nucleatum-阳性的患者的17个氨基酸的长度增加，18个氨基酸的长度减少。F. nucleatum-阳性结直肠癌患者和结直肠癌患者中18个氨基酸减少。

      F. nucleatum-阳性的CRC患者与HC个体的CDR3克隆比例比较，差异有统计学意义(图6d)。F. nucleatum-阳性CRC患者、F. nucleatum-阴性CRC患者和HC个体间HEC数比较，差异有统计学意义(图6e)。这表明，与F. nucleatum-阴性CRC患者相比，F. nucleatum-阳性CRC患者的CDR3序列的大克隆片段明显增加。这一特征与CRC与HC的差异是一致的。热图显示，大多数HC个体、F. nucleatum-阳性CRC患者和F. nucleatum-阴性CRC患者的CDR3序列不同，只有少数常见序列(图6f)。

图6

结论

      研究中大队列多组学数据表明，在结直肠癌的发展过程中，TCR的克隆性、微生物组和遗传学发生了变化。验证了微生物组、TCR和靶基因之间的相关性，并成功鉴定了CRC患者和HC个体的几种微生物和TCR生物标志物。目前，这是第一个报道基于微生物组和TCR的随机森林分类器用于区分CRC患者和HC个体的研究。研究揭示了TCR、肠道微生物组和体细胞突变影响CRC的生物标志物，这可能会改变临床实践。

      越来越多的证据表明，基于深度测序的T细胞库可以作为癌症患者免疫反应的生物标志物。基于TCR基因测序来评估淋巴细胞浸润的新技术提供了克隆信息和丰度。CRC组与HC组HEC比较，CRC组HEC比值明显高于HC组。高克隆性表明只存在少量丰度的克隆，低克隆性表明存在多个丰度相似的克隆。研究结果表明，CRC患者的CDR3序列具有较高的克隆性，而TCR多样性较HC个体差。此外，CRC患者和HC个体在氨基酸序列、Vβ和Jβ基因、CDR3长度等方面存在显著差异。

      总之，研究了结直肠癌靶基因体细胞突变与TCR克隆性和微生物生物标志物的相关性。最后，构建了宏基因组和TCR测序诊断标记来区分CRC患者和HC个体。与F. nucleatum-阴性CRC患者相比，F. nucleatum-阳性CRC患者的CDR3序列显示出大克隆片段的显著增加。本研究首次构建了基于微生物组和TCR的随机森林分类器，用于区分CRC患者和HC个体。由于CRC-预测随机森林分类器具有强大的识别能力和预测能力，研究结果突出了将微生物组和TCR研究与治疗管理联系起来的可能性。