单细胞测序揭秘：化疗对复发卵巢癌患者免疫反应与TCR/BCR克隆扩增的深度影响

• 收集患者标本和HGSOC scRNA-seq数据

• 单细胞悬浮液的制备

• 单细胞RNA-seq、TCRseq和BCR-seq文库的制备

• 免疫组织化学染色

• 单细胞序列数据处理

• 集成、降维和无监督聚类

• 差异表达基因鉴定及基因集富集分析

• G2/M相识别

• 单细胞轨迹分析

• CellChat分析

• CNV分析

• 流式细胞术分析

• 细胞因子测定

• TCGA数据分析

• 单细胞TCR和BCR测序文库的处理

• 单细胞TCR和BCR克隆型分析

• 单细胞TCR/BCR V(D)J测序及分析

• 生存分析

• 统计分析和数据可视化

     为了阐明卵巢癌患者的特征，尽管接受了标准和广泛的治疗，但经历了从化疗敏感到耐药的逐渐转变和肿瘤反复复发，评估了IIIC期HGSOC患者。患者最初接受了最优手术减压，随后接受了紫杉醇联合奈达铂治疗，17个月后首次复发，提示铂敏感复发性卵巢癌。不幸的是，她又经历了三次复发，血清CA125/HE4和影像学显示再次上升，每次复发时她的PFS变短(从7个月到4个月到2个月)，表明她出现了化疗耐药(图1A)。

      为了表征这些样品的细胞成分，使用10x Genomics平台生成并分析了单细胞转录组谱(图1B)。基于已知的细胞类型标记，通过对分布随机邻居嵌入(t-SNE)显示的5种细胞类型进行了识别和分类:肿瘤细胞(EPCAM, PAX8, WT1)，髓细胞(CD14, AIF1, CSF1R)， NK/T细胞(CD2, CD3E, CD3D, GZMA, GNLY, NKG7)， B淋巴细胞(CD19, CD79A, MS4A1)和癌症相关成纤维细胞(cas) (PDPN, DCN, THY1)(图1C, D)。与先前HGSOC单细胞测序报告相似，上皮癌细胞是肿瘤组织中最丰富的细胞成分，其次是髓细胞。与以往的研究相反，免疫细胞在腹水中占主导地位，但在作者的研究中很少在肿瘤中发现。CAFs在肿瘤组织和腹水中均呈稀疏分布(图1E)。此外，与腹水相比，肿瘤中的T细胞较少(图1E)。因此，这些发现提示上皮细胞和免疫细胞在复发中的潜在作用。

图1

      接下来，作者分析了复发的孤立性肿瘤和腹水中癌细胞的固有特征。发现了9个上皮恶性细胞簇(图2A)。输卵管上皮(FTE)标志物PAX8和KRT7在所有亚群中均过表达，提示肿瘤可能起源于FTE(图2B)。此外，C3-EOC-MKI67 (EC3)亚群显示出更高的化疗耐药相关基因(FEN1、NEK2、TOP2A和MKI67)的表达(图2C)。利用Seurat的CellCycleScoring功能，确定EC3亚群细胞主要处于S期和G2/M期，表明它们具有高增殖状态(图2D)。EC3在氧化磷酸化、细胞衰老、G2/M检查点、DNA修复途径、糖酵解和脂肪酸代谢等几个途径中，种群表现出相对较高的富集(图2E)。这些结果提示，EC3细胞的增殖、高代谢和耐药特性可能与卵巢癌的进展和复发有关。

      CNV分析结果显示，作者的样本(EOC_Tumor) CNV水平升高(图2F)。此外，作者还探讨EC3簇是否是化疗耐药肿瘤的特征性簇。总之，这些结果提示MKI67阳性的癌细胞可能有助于HGSOC的化疗耐药。

      接下来，作者评估了癌细胞中抗原呈递相关基因的表达。与之前的报道相似，HLA-B和HLA-C在亚簇中普遍表达明显(图2G)。此外，干扰素(IFN)通路相关基因在大多数肿瘤细胞亚簇中均匀富集。代表IFN通路核心基因的IFN应答相关基因(如IFI27、IFITM3、LY6E)在肿瘤细胞中显著升高( 补充图S1H。为了验证我们的发现,作者在GEO数据库(GSE154600)中对这些基因的表达进行了表征，并获得了相似的表达谱(图2H)。为了进一步预测IFN相关基因在HGSOC中的潜在功能，作者使用OV-TCGA数据集进行了基于这些基因的生存分析，结果表明IFN相关基因的高表达与更好的预后相关(log-rank法，P= 0.039 补充图SI)。因此，IFN表达谱(图2H)的富集可能提示该患者免疫应答较强，预后较好。然而，该患者的PFS3逐渐缩短，需要进一步研究肿瘤免疫微环境(TIME)。

图2

     为了更好地阐明TIME，作者分析了第四疗程化疗前收集的样本中的17301个免疫细胞，其中910个来自肿瘤细胞，5949个来自腹水细胞，10442个来自pbmc细胞。根据先前表征的标记物鉴定出四种主要的细胞类型，包括T细胞(CD3D, CD3G, CD2)， NK细胞(NKG7, GNLY, KLRD1, KLRF1)， B细胞(MS4A1, CD19, CD79A, CD79B)和骨髓细胞(CD14, AIF1, CSF1R)(补充图S2A-C)。T细胞和骨髓细胞是腹水和肿瘤中占优势的免疫细胞(补充图 S2D)，这与其他研究一致。

     接下来，作者对骨髓细胞进行聚类分析，发现了12个簇(图3A)。值得注意的是，MKI67单核细胞和APOE巨噬细胞主要来自肿瘤，而ADAP2和MARCO巨噬细胞主要来自腹水(图3B)。使用先前报告中鉴定的标记物，作者发现APOE巨噬细胞表现出TAM样特征(TREM2, APOE)，而ADAP2巨噬细胞高度表达MDSC样特征(S100A8, FCN1)(图3C)。此外，这两个集群显示高表达M2样特征(CD163, MRC1)，而腹水来源的MARCO巨噬细胞高表达具有M1- (CD68, CD86)和M2样特征的MDSC样特征(图3C)。接下来，作者通过伪时间分析探索了来自不同部位的骨髓细胞的轨迹。除了MKI67单核细胞外，PBMC来源的单核细胞分为腹水常驻巨噬细胞群(ADAP2和MARCO巨噬细胞)和肿瘤常驻巨噬细胞群(MKI67单核细胞和APOE巨噬细胞)(图3D)，这表明外周单核细胞可能迁移到腹水和肿瘤，并在TIME中被教育为不同的亚型。

     为了描述巨噬细胞在腹水和肿瘤中的不同功能，我们比较了不同亚群中富集的KEGG通路。与APOE簇相比，ADAP2和MARCO簇均表现出较低的细胞因子受体相互作用富集(图3E, F)，表明腹水中巨噬细胞的活化和细胞毒性受损。

图3

     为了阐明T细胞在TME中的作用，我们根据肿瘤、腹水和PBMCs细胞表面标志物的表达对T细胞进行了聚类(图4A、B)。7个T细胞簇的特征如下:活化T细胞(PRF1)、记忆T细胞(S100A4、GPR183)、naïve T细胞(SELL、LEF1、CCR7)、Tregs细胞(CTLA4、FOXP3、FOXO1)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL) (GZMA、NKG7、GZMH、GZMB)、粘膜相关不变T细胞(MAIT) (SLC4A10、TRAV1-2)和γδT细胞(TRGV9、TRDV2)(图4C)。TC2-XIST (TC2)、TC4-FOSB (TC4)和TC8- bcl2 (TC8)簇主要来源于腹水，其他簇主要来源于PBMCs(图4B)。值得注意的是，TC2和TC4集群的特点是T细胞标志物低表达(图4C, D)，如RORC, TRDC和ZBTB16。

      由于γδT细胞具有CD4和CD8负表达的特征，作者使用R包SingleR将TC4注释为Vd2 γδT细胞，将TC2注释为非Vd2 γδT细胞(图4E)，提示TC2可能代表一个新的T细胞亚群。此外，对TC2簇的基因集富集分析显示，染色质组织调控基因显著富集，从而暗示其在形成腹水中T细胞免疫群落中的潜在作用(图4F)。有趣的是，TC2簇中显著富集的途径包括凋亡、RIG-I-样受体信号传导、赖氨酸降解和硫代谢途径，而核糖体和氧化磷酸化(OXPHOS)途径则呈现低水平富集(图4G)。鉴于OXPHOS通路是TIME内T细胞的特征性代谢表型，其低水平富集，与凋亡通路的高富集和核糖体功能通路的低富集一起，表明TC2的免疫功能减弱。

图4

      在外周血源性T细胞中，作者根据典型标记确定了11个亚群(图5A-C)。CD4⁺细胞包括记忆性CD4⁺ T细胞(S100A4⁺GPR183⁺)、调节性CD4⁺ T细胞(Treg) (FOXP3⁺IL2RA⁺)和调节性CD4+ T细胞(CCR7⁺SELL⁺) (CD4-C1-naïve-LTB和CD4-C2-naïve-LEF1组成)。CD8⁺ T细胞的5个亚群，包括naïve CD8⁺T细胞(CCR7⁺ SELL⁺)和4个CD8⁺ T细胞效应亚群(CD8-c1-effector-NKG7、CD8-c2-effector-GNLY、CD8-c3-effector-GMZB和CD8-c5-effector-ZNF683)表达高水平的GZMA和NKG7。此外，作者还定义了一个MAIT子集(SLC4A10⁺TRAV1-2⁺)和一个γδT子集(TRGV9⁺TRDV2⁺)。在所有CD8⁺ T细胞中均检测到耗竭标志物LAG3、CD244和EOMES的表达(图5C)，其中CD8⁺-c2-effector-GNLY组TCR克隆扩增最为广泛(图5D、E)。

     进一步进行化疗前后细胞比例分析。在CD8⁺ T细胞中，化疗后C3-effector-GZMB (4.1% vs 3.7%)和c5-effector-znf683 (0.8% vs 0.7%)群体增加，c1-effector- NKG7 (14.7% vs 16.0%)和c2-effector-GNLY (8.4% vs 9.4%)群体减少(图5F)。重要的是，CD8⁺ GZMB T细胞和CD8⁺ ZNF683 T细胞被认为是耗尽或耗尽样细胞，尽管它们具有细胞毒性功能)。因此，CD8⁺ T细胞亚群中细胞比例的变化表明其趋向于衰竭状态，这可能反映了化疗的累积效应。

     接下来，为了研究化疗是否会促进T细胞衰老，作者采用GSVA方法比较了pbmc衍生的T细胞簇中细胞衰老基因集(来自KEGG, hsa04218)的富集水平。T细胞衰老的特征是功能失调和终末分化细胞的积累，在CD8 -c3-effector-GMZB T细胞簇中，衰老相关基因组显著富集(图5G)。

     值得注意的是，包括CD8-C3-Effector-GZMB在内的所有T细胞簇在化疗后都获得了更高的细胞衰老相关基因的富集，这强烈暗示化疗促进并加速了T细胞的衰老(图5G)。因此，作者的研究结果表明，化疗诱导了衰老样T细胞，包括CD8-C3-Effector-GZMB T细胞，这可能是HGSOC中具有耗尽表型的功能失调亚群。

图5

     化疗是否会引起TCR克隆扩增的改变尚不清楚。因此，作者分析了化疗期间TCR库的动态。值得注意的是，还作者观察到化疗后独特T细胞克隆型的数量和比例增加，占所有克隆型的70%以上(图6A)。化疗前后共有154种不同的克隆型(图6B)。这些数据强烈表明化疗改变了TCR克隆扩增。有趣的是，与CD8⁺ T细胞相比，CD4⁺ T细胞的多样性指数(Shannon, Simpson, Chao和ACE指数)更高。CD4⁺ T细胞簇内克隆重叠不明显，而CD8⁺T细胞簇内存在较强的重叠，特别是CD8-c1-effectorNKG7和CD8-c2-effector-GNLY细胞之间(补充图S7E, F)。此外，高扩增的克隆型相对丰度下降，低克隆指数的克隆型在化疗后占据更多的库空间(图6C和补充图S7B、D)，提示TCR克隆扩增的变化可能与低克隆指数的克隆型有关。因此，化疗似乎诱导了所有T细胞的TCR克隆扩增，并且对CD4⁺ TCR的影响更为明显。

     由于互补决定区3 (CDR3)是直接与抗原接触的TCR区域，因此在TCR与肽MHC复合物之间的相互作用中起着重要作用，我们接下来研究了化疗是否改变了不同克隆型中α/β链内CDR3的分布。化疗前后CDR3 α/β链氨基酸(aa)长度分布基本一致，27aa是最常见的长度(图6D, E)。优势CDR3序列的克隆型减少，化疗后CVSGDIPTF_CASSSRYSGNTIYF序列消失(图6F)。V(D)J重排是TCR/BCR多样性的基础，使T/B细胞对多种抗原产生免疫反应。因此，作者进一步分析了化疗前后α链和β链上V-J对的偏倚。有趣的是，TRAV5 – TRAJ47、TRAV1-2-TRAJ33和TRAV17-TRAJ54这三对使用频率最高的α链在化疗后保持不变，而其他较少使用的α链在化疗后变化更大(图6G)。在β链中，TRBV7-8-TRBJ2-5、TRBV20-1-TRBJ2-7和TRBV20-1TRBJ2-1是化疗前后使用最多的三个V-J对，而其他较少使用的V-J对则发生了显著变化(图6H)。总之，基于克隆型和CDR3分析，这些发现表明TCR库的变化可能与低频V-J对的低扩增克隆型有关。

     为了评估化疗对外周血B细胞表型和功能的影响，作者分析了scRNA-seq和scBCR-seq数据。共获得1690个B细胞，并保留1631个具有全长高效配对的IGH-IGK/IGL链的细胞供进一步分析。根据典型标记的表达，将B细胞分为三个不同的亚群:naïve B细胞(IGHD)，记忆B细胞(CD27, IGHA1, IGHG1)和浆细胞(CD38, XBP1)(图7A, B)。naïve B细胞由IgM、IgD、IgG和IgA同型组成，占外周血B细胞的大多数。所有B细胞均为中位扩增(图7A)。化疗后浆细胞(5.10% vs 3.92%)和记忆B细胞(22.45% vs 20.54%)的百分比增加，naïve B细胞的百分比下降(72.45% vs 75.54%)(图7C)，提示化疗诱导的新抗原可能导致naïve B细胞向浆细胞或记忆B细胞分化。与NF-kB信号通路(CD74)、MAPK信号通路(FOS、DUSP1)相关的几个关键基因在化疗后naïve和记忆细胞中均显著上调，提示化疗可能诱导B细胞活化、增殖和成熟(图7D)。利用R包Clusterprofiler，作者还发现化疗后naïve B细胞中多种炎症反应通路显著富集，而记忆B细胞中蛋白合成和RNA分解代谢通路富集(图7E)。

      接下来，作者探讨了化疗期间BCR谱的动态变化。有趣的是，作者还观察到化疗前后独特克隆型的比例一致，并且没有共享独特克隆型(图7F)，这表明BCR克隆扩增的显著变化可能主要归因于化疗。值得注意的是，克隆型的相对丰度和相应克隆指数的占用空间没有明显增加(图7G)，这与TCR分析的结果(图6C)不同。

      通过整合来自配对腹水、肿瘤和外周血样本的单细胞RNA、TCR和BCR谱的横断面分析，为一个有几个复发周期和化疗耐药的HGSOC患者的TME提供了重要的见解。

     揭示了TCR和BCR克隆扩增的可变变化，为了解宿主抗肿瘤免疫机制和化疗诱导的免疫重建奠定了基础。

     作者的研究也为深入探索复发铂耐药HGSOC的癌变和免疫环境提供了可能，这可能有助于开发新的化疗药物联合抗衰老药物，以改善卵巢癌患者的预后和总生存期。

参考文献

Ren Y, Li R, Feng H, Xie J, Gao L,Chu S, Li Y, Meng F and Ning Y (2022)Single-cell sequencing reveals effects of chemotherapy on the immune landscape and TCR/BCR clonal expansion in a relapsed ovarian cancer patient.Front. Immunol. 13:985187.doi: 10.3389/fimmu.2022.985187

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