传染病与免疫系统功能息息相关，免疫组库测序在传染病中的应用也越来越广泛，许多传染病的免疫相关机制仍有待探索。2024年11月27日艾沐蒽与清华大学医学院传染病研究中心联合在Frontiers in Immunology发表题为“T-cell receptor and B-cell receptor repertoires profiling in pleural tuberculosis”的文章, 表征了胸膜结核（PLTB）的TCR和BCR库，并鉴定了结核分枝杆菌（Mtb）特异性克隆，为结核病诊断、治疗和疫苗开发提供重要线索。
研究方法
纳入10例PLTB患者，采集外周血单核细胞（PBMC）和胸腔积液单核细胞（PEMC），纯化T细胞，进行DNA+多重建库方法的TRB、TRG、IGH链PE150测序（图1）。并进行NGS的HLA分型测定，使用GLIPH2算法进行特异性TCR序列鉴定。
图1
研究结果
PART.01
PLTB患者的TRB库特征：每位患者的胸腔积液和血液中都有共享的TRB克隆，在胸腔积液和血液之间没有克隆性和香农指数差异（图2A），说明在Mtb感染的早期阶段，T细胞可以从外周血进入胸腔积液。
胸腔积液和血液中TRB V或J基因分布模式相似，但在一些患者中特定V或J基因使用频率也存在一些差异。例如，在患者19中，TRBV5-3 和 TRBJ2-3 在胸腔积液中的使用比例明显比血液更高（图 2B-E）。
Morisita指数分析显示，PLTB患者胸腔积液和血液之间的TRB库相似性较低（图 2F、G）。作者分析了出现在至少7例胸腔积液或血液中的克隆，8例胸腔积液共有3个共享克隆，9个血样有1个共享克隆（图 2H、I）。这些克隆是 Mtb特异性克隆还是保护性克隆需要进一步研究。
图2
PART.02
TRG库特征：所有9名PLTB患者在胸腔积液和血液中都有共享一些TRG克隆（图3A）。在胸腔积液或血液之间具有相似的 V 段或 J 段分布模式（图 3B、C），但在患者22和患者100中，TRGV3 和 TRGV8 在血液中的使用频率比胸腔积液更高。
一些样本具有较高的TRG Morisita指数，比如E10和 E101，以及P10和P101（图F、G）。所有9个胸腔积液样本中有224个TRG共享克隆，9个血液样本中有64个TRG共享克隆（图3H）。
图3
PART.03
IGH库特征：所有8名入组的PLTB患者在胸腔积液和血液样本中共享了一些 IGH 克隆（图4A）。大多数患者在胸腔积液和血液中具有相似的 V 或 J 基因片段分布，在患者19中，血液中IGHV4基因的使用频率明显高于胸腔积液，表明个体PLTB患者也存在不同的免疫反应（图4B-E）。
Morisita指数表明，一些胸腔积液和血液样本之间存在共享的IGH克隆，这些克隆可能是潜在的Mtb特异性IGH克隆（图4F、G）。在7个胸腔积液中观察到2个共享的IGH克隆，在5个血样中观察到5个共享克隆（图 4H、I），表明这些抗体可能在患者中发挥作用，需要进一步研究。
图4
抗体反应：通过ELISA测试了 IgA 、 IgG 和 IgM 抗体亚型对Mtb抗原的反应。结果表明，PLTB患者对血液和胸腔积液中的Mtb抗原存在不同的抗体反应（图 5A-D）。比如与胸腔积液相比，血浆中对全H37Rv细菌和LAM抗原的 IgA抗体反应水平更高（图 5A、C）。
图5
PART.04
Mtb特异性TCR序列鉴定：使用GLIPH2分析了9名胸膜结核患者胸腔积液和血液中的TRB序列，共确定了15,913个具有一组特定过滤标准的高质量共享特异性组。三对患者的胸腔积液在共享特异性组中的重叠比例最高，分别为22.4%、20.1% 和 17.1%，血液中重叠比例最高TOP3为19.2%， 17.6% 和 14.3%（图 6A、B）。当结合血液和胸腔积液特异性组时，特异性TCR组重叠最高的三对患者其重叠比例高达53.5%、53.3% 和 48.1%（图 6C）。
分析患者胸腔积液和血液之间共享的特异性组，结果表明，与不同患者相比，同一患者胸腔积液和血液之间的重叠通常更高（图 6D）。在所有PLTB患者胸腔积液的所有聚集性集群中，患者22的特异性集群最高，占50.4%（图 6E）。患者10在所有患者的胸腔积液和血液中具有最相似的特异性集群（6.1%）（图 6F、G）。
鉴定了每个样本中的Mtb特异性TRB克隆，47个克隆由所有患者的胸腔积液和血液共享（图6H）。与健康对照组相比，PLTB患者血液、胸腔积液或两者中Mtb特异性TRB克隆的比例显著更高。这表明患者对Mtb具有特异性T细胞反应，并且反应发生在血液和胸腔积液中（图 6I）。
图6
研究结论
在这项研究中，采用高通量测序技术表征了PLTB患者的适应性免疫反应，研究了异同，并分析了胸腔积液和血液中的共享克隆，这可以更准确地了解结核病免疫反应，有助于结核病诊断的发展和寻找新的免疫原用于疫苗开发。