近年来过继细胞疗法（ACT）快速发展，包括CAR-T、TCR-T、TIL疗法等为治愈癌症带来无限希望。但实体肿瘤免疫微环境会抑制ACT疗法的抗肿瘤能力，如何克服肿瘤诱导的免疫抑制是提高ACT治疗效果的关键。上海交通大学王世成等人在Cancer Immunol Immunother上发表题为“Cryo-thermal therapy reshaped the tumor immune microenvironment to enhance the efficacy of adoptive T cell therapy”的文章，该研究发现冷冻热疗（CTT）可以重塑肿瘤免疫微环境，增强ACT治疗疗效，通过采用艾沐蒽ImmuHub®TCR测序分析平台发现CTT联合ACT疗法能够增加肿瘤内特定T细胞克隆的比例，这可能有助于提高治疗效果。
研究结果 使用流式细胞术检查接受不同治疗后小鼠远端肿瘤内先天免疫细胞的浸润。作者发现，先天免疫细胞，包括嗜中性粒细胞、巨噬细胞和DC，早在CTT后24小时就在肿瘤内显著增加（图1F）。通过免疫组化染色发现，与对照组相比，CTT后CD11b+骨髓细胞的浸润增加（图1G）。这些结果表明，CTT诱导了急性炎症反应，促进了先天免疫细胞的浸润，从而重塑了远端肿瘤的免疫环境。01CTT重塑远端肿瘤免疫微环境作者通过在小鼠的右侧和左侧分别接种5×105和104个 B16F10细胞来建立双侧肿瘤模型。接种后12天，对右侧（大）肿瘤进行CTT，在CCT后7天收集左侧（小）肿瘤进行RNA测序 （RNA-seq）（图1A）。与未治疗的对照组相比，CTT组左侧肿瘤的基因表达谱发生了显著变化，336个基因上调，142个基因下调（图1B-C）。左肿瘤中同种异体移植物排斥反应、干扰素 α 和 γ 反应、炎症反应和 IL-6/JAK/STAT3 信号通路显著富集（图1D）。同时，左侧肿瘤中中性粒细胞趋化性、迁移、外渗和单核细胞迁移途径以及巨噬细胞的活化和M1极化以及巨噬细胞和树突状细胞（DC）途径中的细胞因子产生不受调节（图1E）。
图1 在CTT后14天收集小鼠脾T细胞进行体外刺激扩增，通过流式细胞术进一步评估CTT后扩增的脾T细胞的功能。图2A-B展示了CD 4+和CD 8+中CD 69、IFN-γ、穿孔素和颗粒酶B的表达，与扩增前T细胞相比，体外扩增后的T细胞高度活化。作者假设来自接受CTT的小鼠的扩增的脾T细胞能够作为ACT的细胞来源。为了验证ACT在体内的抗肿瘤功效，将扩增的脾T细胞过继转移到双侧小鼠肿瘤模型中，并在CTT后7天通过HE染色评估左侧肿瘤的坏死（图2C）。来自单独ACT治疗的小鼠的肿瘤没有坏死，但联合治疗组观察到实质性固缩、核碎裂和核溶解，说明引起了肿瘤广泛坏死（图2D）。结果表明，CTT能有效增强ACT的抗肿瘤作用。02
图2
为了进一步研究CTT增强ACT抗肿瘤能力的免疫学机制，在CTT后第7天对来自对照组、CTT组、ACT组和联合治疗组的左侧肿瘤进行RNA-seq。与单独的ACT相比，组合疗法显著上调左侧肿瘤中的干扰素γ和α应答、同种异体移植物排斥、炎症应答和IL-6/JAK/STAT 3信号传导途径（图3A）。同时，联合治疗组中的嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞趋化途径以及DC中的细胞因子产生途径富集（图3B）。这些结果再次证实了CTT重塑了远端肿瘤的免疫环境。此外，与ACT单药治疗相比，联合治疗组中与抗原加工和呈递途径相关的基因显著富集。(图3C）。然后通过流式细胞术测量肿瘤内抗原呈递细胞上MHC-II的表达。与对照组相比，只有联合治疗组中显示出DC、单核细胞和巨噬细胞上MHC-II表达的显著上调（图3D-F）。因此，在CTT介导的肿瘤免疫环境重塑之后，联合治疗进一步增强了先天免疫细胞的抗原呈递功能。03
图3
04 使用GSEA分析GO生物过程基因集中的T细胞相关免疫途径。与单独ACT相比，联合治疗组中T细胞介导的免疫和细胞毒性途径广泛不受调节（图4A）。且联合治疗后肿瘤中CD 4+T细胞和CD8+T细胞的比例显著增加（图4B）。这可能归因于它们的活跃增殖，因为CD4+和CD8+T细胞内Ki 67的表达显著增加（图4C）。免疫组化染色显示，与另一组相比，联合治疗后肿瘤内CD3+T细胞的数量显着增加（图4D）。与对照组和CTT组相比，在联合治疗组中观察到肿瘤内CD62−CD44+效应记忆T细胞（TEM）的比例显著增加（图4E）。同时，联合治疗显示出IFN-γ、颗粒酶B和穿孔素在CD8+T细胞中的表达显著增加（图4F）。编码颗粒酶和穿孔素的基因如GZMA、GZMB、GZMG和PRF1的表达在联合治疗后也增加（图4G）。这些结果表明，联合治疗可以进一步促进T细胞的增殖和效应功能，导致T细胞介导的抗肿瘤免疫的最大化。
图4
05 T细胞受体（TCR）决定T细胞的特异性，作者在CTT后第7天对对照组、ACT、CTT和联合治疗组的左侧肿瘤进行TCRβ测序。ACT和CTT将top5 TCR克隆的频率分别从9.78显著增加至17.35%和15.49%，而联合治疗进一步增加了top5 TCR克隆的频率（22.09%）（图5A）。同时，联合治疗中的TOP5 TCR克隆可以在其他组的肿瘤中检测到，这表明这些扩增的TCR克隆具有潜在的肿瘤特异性（图5B）。这些结果表明联合治疗促进了肿瘤内T细胞的浸润和扩张。
图5
为了进一步证明联合疗法的治疗功效，用CTT治疗双侧荷瘤小鼠B16 F10的右侧肿瘤作为靶病灶，并且将左侧肿瘤用作观察病灶以监测肿瘤大小。扩增来自CTT处理的小鼠的脾T细胞，并在CTT处理后1天输注于小鼠（图6A）。单独的ACT不能抑制观察病变的生长，CTT处理的小鼠显示出观察到的病变生长轻微减少，但没有显著差异，而联合治疗显著抑制了左侧观察到的病变的生长（图6B）。为了验证联合治疗对恶性肿瘤的疗效，使用了4T1小鼠乳腺癌模型，与对照小鼠相比，CTT显著提高了小鼠的存活率（图6C）。在长期观察期内，与单独的CTT相比，联合治疗将小鼠的存活率从约50%增加至约90%（图6C）。这些数据表明，联合治疗可以限制远端肿瘤生长并消除微转移。06
图6 通过艾沐蒽ImmuHub®TCR测序技术探索了T细胞免疫环境的变化，证明了CCT联合ACT治疗更能激活T细胞克隆扩增，发挥抗肿瘤作用。
杭州艾沐蒽生物科技有限公司成立于2016年，是国际前沿的专注于免疫驱动医学技术的国家高新技术企业。创始人团队来自美国芝加哥大学，在2010年开始使用免疫组基因高通量测序技术开展各种疾病相关研究，于2016年通过自主研发，全国首家推出NGS-MRD血液肿瘤微小残留病（MRD）检测Seq-MRD®，并授权泛生子使用。同时，公司拥有Immun-Traq®肿瘤治疗伴随诊断、Immun-Cheq® |T细胞免疫测评以及ImmuHub®免疫组测序科研服务产品，并布局有基于AI机器学习算法的T-classifier®肿瘤早筛、单细胞测序、TCR-T和抗体发现等平台管线。目前为止发表了数十篇论文，其中包括：The New England Journal of Medicine(IF:158.5), Nature(IF:65), Signal Transduction and Targeted Therapy(IF:40), Cellular and Molecular Immunology(IF:24), Nature Communications (IF:17)等多篇高分杂志。公司构建几十项发明专利和软件著作权为核心的自主知识产权体系，为医院临床、生命科学研究、新药开发等提供解决方案和产品。艾沐蒽专注于通过解码适应性免疫系统来改变疾病的诊断和治疗，并致力于推进免疫驱动医学领域发展。