越来越多的研究证明传染病的病理机制与免疫系统息息相关，因此免疫组测序在传染病研究中的应用越来越广泛和重要。2024年12月21日复旦大学方钟教授团队在柳叶刀子刊EBioMedicine（IF：11.2）上发表题为“Combination of spatial transcriptomics analysis and retrospective study reveals liver infection of SARS-COV-2 is associated with clinical outcomes of COVID-19”的文章，该研究通过空间转录组分析、免疫组库分析和临床病例回顾性研究相结合，揭示了SARS-CoV-2对肝脏的影响并探索潜在的机制。文中采用艾沐蒽的ImmuHub®TCR测序分析系统，揭示COVID-19死亡病例与幸存病例肝脏组织的免疫特征及差异。
研究结果
01COVID-19患者肝脏中的SARS-CoV-2的空间景观
首先作者在SARS-CoV-2感染仓鼠的肝脏中检测到SARS-CoV-2 S和N蛋白，使用抗病毒S或N蛋白抗体对临床病例肝组织样品进行染色，在重症患者和所有尸检的肝组织中检测到S和N蛋白，而在中度疾病患者的肝脏或乙型肝炎对照组织中未检测到。这表明，肝脏中的病毒攻击与COVID-19的严重程度有关。
然后分析了一例中度、一例重度和一例已故患者的肝脏组织中的空间转录组。已故病例样本共生成了4981个斑点，分为十个簇（图1c）；重度病例生成了751个斑点，分为五个簇（图1b）；中度病例生成了271个斑点，分为三个簇（图1a）。仅在重症患者和已故患者中检测到SARS-CoV-2 RNA，而在中度患者中未检测到（图1d和e）。在重症病例的所有簇中均检测到病毒RNA并且在簇2、3和4中含量更高（图2d）。在已故患者的第1至9簇中检测到病毒RNA，在第3、4、5、8簇中病毒RNA含量较高（图1e）。
图1f-l展示了从切片中获得的s蛋白染色样品的IHC图像，在重症病例中，簇 2、3 和 4（图 1h-j）包含更多的SARS-CoV-2蛋白。在死亡病例中，病毒蛋白表达在簇 3、4、5 和 8 中较强（图1o-q和t）。这些发现表明SARS-CoV-2可以感染肝脏的特定区域。
图102SARS-CoV-2感染肝脏的肝内免疫特征
作者检查了PTPRC的水平，PTPRC编码CD45，CD45是免疫细胞的泛标志物。在已故患者中，约5%的斑点是PTPRC阳性，在重症患者中大约25.3%的斑点是PTPRC阳性（图 2a）。PTPRC表达在已故患者的任何簇中均未富集，但在幸存的重症患者的第2、3、4簇中富集（图2b）。而这些簇也富含病毒RNA，这表明免疫细胞参与肝脏病毒控制。
此外，还分析了巨噬细胞、粒细胞、 B细胞、 NK细胞和T细胞的标记基因（图2c-f），这些基因在病毒蛋白丰富的簇中表达水平明显增加，尤其是在簇3中。然后作者诱导CD3和病毒N 蛋白的IF染色。在重症和死亡患者的肝脏中检测到病毒N蛋白，但在中度患者的肝脏中未检测到（图2g）。在幸存的重症患者中，更多的CD3+细胞与病毒阳性细胞相邻，但在已故患者中则没有（图2g）。TCR的相关基因包括TRAC、TRAC1、TRBC2在簇3中高度表达（图2h）。
然后对FFPE肝组织进行了TCR测序，以比较重症患者和已故患者之间的免疫特征。与已故患者相比，幸存重症患者的TCRα 链CDR3长度更短（图2i），在幸存重症患者中具有高度扩增的克隆（图2j）。另外在幸存的重症病例中，观察到TCRβ链V20-1和J207的新重组（图2k）。这些结果表明，T细胞对 SARS-CoV-2的肝内控制至关重要。
图203SARS-CoV-2感染后肝脏的分布和变化
空间转录组学分析显示，中度、重度和死亡病例的样本簇中富集了特征基因（图3a-c）。已故患者的簇5和8的白蛋白（ALB）水平明显降低（图3e），而在重症病例的簇中的ALB表达保持不变（图3d）。
随后对ALB降低的簇5和8中前1000个上调基因进行了GO生物过程富集。发现簇5和8的一些基因在凋亡过程中富集（图3f和 g）。此外，在簇5中鉴定出外源性凋亡通路（图3f），而内源性凋亡通路在簇8中趋于被激活（图3g）。与氨基酸代谢及代谢过程相关的基因表达在簇5和8中均显著降低（图3h和i）。这些数据表明，由于细胞死亡，所有转录本可能普遍下降。ACTB（编码β-肌动蛋白）和TUBB（编码β-微管蛋白）在凋亡簇中均减少，尤其是在簇5中（图3j和k）。这些发现表明，肝细胞的蛋白质合成功能受到SARS-CoV-2的严重损害，促进了其在已故患者中的凋亡。
图304ALB浓度的动态波动与COVID-19患者的预后相关
回顾性研究了COVID-19住院患者，包括165名死亡患者，122名重症患者和363名中度患者。没有观察到已故、重度和中度队列之间的基线丙氨酸氨基转移酶（ALT）或γ-谷氨酰转移酶（GGT）水平有任何差异（图4a-c）。天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平随着疾病严重程度的增加而增加（图4b）。相比之下，基线ALB浓度随着严重程度的增加而降低（图4d）。
然后检查了ALB水平的波动。每组患者ALB波动变化见图4e-g，在死亡组中，ALB浓度降至正常水平以下（图4e），而在重度和中度队列中，ALB浓度趋于增加（图4f和g）。起点和终点之间ALB水平的比较表明，死亡组中，研究开始时ALB水平下降的患者在研究结束时没有恢复（图4h），即使ALB浓度最初恢复正常，到研究结束时也会下降（图4i）。相比之下，在存活的患者中，ALB水平最初下降的患者倾向于恢复（图 4j），而ALB水平正常的患者保持这一趋势直到研究结束（图 4k）。由于肝细胞特异性合成ALB，其减少反映了SARS-CoV-2对肝脏的影响。重要的是，血清ALB浓度的波动可用于评估 COVID-19 患者的死亡风险。
图4
研究结论
该研究通过检测病毒RNA和 S 和 N 蛋白分析了 SARS-CoV-2 的嗜肝性，揭示了病毒在肝脏中的空间分布和免疫特征，并表明TCR的克隆性和重组对于控制肝内病毒至关重要。还证明 SARS-CoV-2 促进已故患者肝细胞凋亡，从而导致 ALB 表达受损。血清 ALB 表达的降低可用于评估患者的死亡风险。参考文献
Chen S, et,al. Combination of spatial transcriptomics analysis and retrospective study reveals liver infection of SARS-COV-2 is associated with clinical outcomes of COVID-19. EBioMedicine. 2024 Dec 21;111:105517. doi: 10.1016/j.ebiom.2024.105517.
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