发表日期：2023年5月 发表期刊：Frontiers in Immunology 肝癌 肝癌是全球癌症相关死亡的第三大原因;肝细胞癌(HCC)占肝癌的90%，5年生存率为18%。约72%的HCC发生在亚洲，其中超过50%发生在中国。乙型肝炎病毒感染是HCC的主要原因，其次是酒精、黄曲霉毒素、丙型肝炎病毒感染和非酒精性脂肪性肝。 免疫库(IR)包括TCR库和BCR库。TCR和BCR的多样性主要由可变(V)、多样性(D)和连接(J)基因片段组成。额外的多样性是通过基因连接区域的非模板核苷酸(N)添加和/或删除而产生的。迄今为止对IR的研究大多集中在TCR(主要是TRB)上，而忽略了其他TCR链和BCR。尽管与T细胞相比，肿瘤中存在较少的B细胞，但肿瘤浸润B细胞在肿瘤免疫中起着至关重要的作用。它们可以表现出抗肿瘤或促肿瘤活性，或与肿瘤浸润性T细胞相互作用。在肿瘤进展过程中，TCR和BCR的特征及其在肿瘤和邻近非肿瘤组织中的作用及其关系尚不清楚。联合肿瘤浸润T细胞和B细胞对TCR和BCR的研究可能阐明肿瘤的IR特征。 研究团队于2014年5月至2018年12月在中国广州南方医院采集64例HCC患者的样本{在肝细胞癌患者切除手术中获得配对肿瘤和邻近非肿瘤组织(至少2cm × 2cm × 2cm)}，采用TCR/BCR – bulk测序、RNA测序、全外显子组测序和人白细胞抗原测序相结合的方法，对64例HCC患者的肿瘤和邻近非肿瘤组织进行免疫库(IR)特征检测。 TCR/ BCR序列的患者队列和特征 在这项研究中，该研究招募了64例病理诊断为HCC的患者，分析TCR和BCR – IgH的差异，以及它们与HCC患者预后的关系。为了更好地分析HCC的IR特征，将TNM 1期定义为早期疾病，TNM 2期及以上定义为晚期疾病。早期和晚期患者分别为31例和33例。所有患者均接受naïve治疗，并在切除手术期间首次诊断为HCC。结合IR-seq、RNA-seq、WES和HLA-seq进行分析(图1A)。肿瘤组织与非肿瘤组织之间TRA、TRB和BCR的序列读数无显著差异(补充图1)。题目：T细胞受体和B细胞受体在肝细胞癌的肿瘤和邻近非肿瘤组织中表现出独特的特征
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补充图1 HCC患者的TCR和BCR特征不同 使用MixCR对所有序列进行筛选后，对HCC患者的TCR和BCR特征进行分析。研究发现非肿瘤组织中BCR和TRG的丰富度和均匀度明显高于肿瘤组织(图1B)。然而，在TCR中，肿瘤组TRB VDJ均匀性明显高于非肿瘤组(图1C)。该研究计算了配对组织中的BCR体细胞超突变(SHM)，发现非肿瘤组织中IgG和IgM突变克隆的百分比高于肿瘤组织(图1D)。这些发现表明，与TRB的多样性相比，BCR、IgH和TRG克隆型在非肿瘤组织中的分布更为丰富和均匀。此外，较高的BCR SHM表明在非肿瘤组织中持续和持久的B细胞反应。综上所述，TCR和BCR在HCC的肿瘤组织和非肿瘤组织中表现出不同的特征。 TCR与BCR相比，肿瘤组织与非肿瘤组织具有更强的相似性和重叠性 为了评估从每个患者获得的肿瘤和非肿瘤组织之间的TCR/BCR的相似性，该研究计算了每个配对样本的MHSI。在所有TCR中，TRD和TRB的相似性最强和最弱。在BCR中，IgM和IgG的相似性最低，IgG的相似性最高，分别为(图1E)。综上所述，TCR的MHSI值均明显高于BCR，说明肿瘤组织与非肿瘤组织之间的BCR相似性弱于TCR相似性。同时，采用主成分分析(PCA)和多维标度分析(MDS)对两组进行比较。MDS仅结合BCR VDJ基因可以很好地定义肿瘤和非肿瘤组织，合并所有重链VDJ基因优于单独使用一个同型(图1F)。其他组合不能区分肿瘤和非肿瘤组织(补充图2)。在肿瘤组织中观察到比非肿瘤组织更大的分散。
补充图2 不同TCR链和/或BCR同型之间的相关性 考虑到TME中的新抗原可诱导T和B细胞反应。此外，B细胞可以向T细胞呈递抗原，它们之间的相互作用可以促进彼此的活化。因此，该研究分析了不同TCR链的丰富度和均匀度之间的相关性(补充图3A）和BCR同型(补充图3B、C）。该研究发现TRA与TRB在丰富度(图2A, E)和均匀度(图2B, F)上的相关性都较高，而TRD与其他TCR/BCR之间的相关性较低(图2A – d)。然而，TCR和BCR之间的相关性在肿瘤组织和非肿瘤组织中表现出不同的特征(图2C, D, G, H;补充图3B、C)。肿瘤中TCR与BCR的丰富度相关性较高，仅在VDJ水平上有统计学意义。然而，在非肿瘤组织中发现了更高的均匀性相关性，仅在CDR3aa中具有统计学意义。总的来说，这些发现表明，在TCR中，TRA和TRB的协作性更强，而TRD的协作性更弱。在TME中，肿瘤组织中TCR和BCR的丰富度变化更同时发生，而非肿瘤组织中TCR和BCR的均匀度变化更同时发生。
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补充图3 肿瘤免疫浸润少 肿瘤组织和非肿瘤组织的IR特征不同，这些特征可能受到TME中元素的影响。该研究结合RNA-seq数据分析了配对组织中一些检查点的表达和免疫浸润。非肿瘤组免疫评分明显高于肿瘤组(图3A)，说明非肿瘤组免疫浸润更多。研究发现肿瘤和非肿瘤组织主要被巨噬细胞M2和CD4记忆性静息T细胞浸润，T细胞滤泡辅助细胞(Tfh)和Tregs在肿瘤中表达较高，而CD8在非肿瘤中表达较高(图3B;补充图4C、D)。此外，研究发现CD28、OX40、GITR、CD137、HVEM、CTLA4、LAYN、CD39和CD103在肿瘤组织中高表达，而在非肿瘤组织中只有LAG3和CD161表达较高(图3C)。这些发现表明肿瘤内微环境受到了更大的抑制。基于这些证据，TME被抑制且复杂，可能影响抗肿瘤反应。 为了进一步研究IR与免疫浸润的关系，该研究分析了IR特征与免疫评分、免疫细胞浸润和检查点表达的相关性(图3D, E;补充图4A)。IR丰富度与免疫评分呈显著正相关，与肿瘤纯度、倍性、TMB、TNB呈显著负相关。IR均匀度与免疫评分的关系较弱，且在配对组织中存在差异。此外，在非肿瘤组织中，初始B细胞丰度与IR特征丰富度呈正相关，均匀度呈负相关。记忆B细胞和浆细胞丰度与IR特征之间的关系产生了相反的结果。红外特征和检查点之间的相关性也发现了类似的结果。综上所述，这些结果表明免疫浸润可能对肿瘤和非肿瘤组织的IR丰富度和均匀度有不同的影响。 通过KEGG(图3F)和GO(图3G)分析肿瘤中信号通路代谢。研究发现免疫相关通路没有异常调节。而肿瘤中DNA复制和atp依赖性活性相关基因富集。研究结果表明，对TCR和BCR特征的影响可能是复杂的，并且归因于多种原因，抑制微环境中TCR和BCR的扩张会相对受到损害。
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补充图4 IR特征与肿瘤临床特征相关性较弱 研究发现大多数临床变量与IR特征之间存在弱相关性(补充图 5A)。更多的变量在均匀性方面具有统计学相关性，特别是在HCC的不同阶段。非肿瘤组织TRA和TRB丰富度与性别显著相关；它们在女性患者中的含量低于男性患者。此外，高血压也可能影响肿瘤中的BCR。吸烟史可能影响非肿瘤组织中IgH和IgG的均匀性。癌栓与IR均匀度的相关性高于其他临床变量(补充图5B)。在非肿瘤中，该研究发现BCR均匀度随着HCC患者年龄的增长而下降；然而，在肿瘤中没有观察到这一发现(补充图5C)。综上所述，IR特征与临床变量之间的关系主要涉及均匀性，在丰富度方面差异不大。
补充图5 早期HCC的TCR/BCR均匀性较高 在肿瘤中，该研究发现早期HCC中TRA和TRB CDR3aa的丰富度和均匀度，以及IgH和IgA的均匀度高于晚期HCC(图4A-D)。同样，在非肿瘤组织中，早期HCC的TRG和BCR均匀度均较高(图4E、F)。所有其他肿瘤IR特征在早期HCC中较高，而晚期HCC非肿瘤组织中TRA和TRB的丰富度相对较高(补充图6A-C)。结果表明，HCC进展后，TCR和BCR均匀度降低；然而，丰富度的变化不如均匀度明显。
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补充图6 晚期HCC患者BCR – SHM较强，免疫评分较高 研究比较了肝癌不同阶段的免疫浸润。在非肿瘤组织中，晚期HCC的免疫评分明显更高(图4I)。同时，在肿瘤中，晚期HCC的免疫评分、倍性、肿瘤纯度、TMB、TNB均高于早期HCC(图7A)。除了TRG外，TCR和BCR的MHSI在疾病分期之间没有差异(图7B)，一些检查点如CD28、OX40、CD27、HVEM、CTLA4、PD1、B7-1、TIM3、VISTA、TIGIT、LAYN和CD39在晚期HCC中的表达水平较高(图4J)。在非肿瘤组织中，研究发现记忆B细胞在早期HCC中表达较高，中性粒细胞在晚期HCC中表达较高。配对组织中其他T细胞或B细胞(图7C, D)和HLA – LOH(图7E)在早期和晚期HCC中无显著差异。最终，在晚期HCC中，肿瘤组织的免疫浸润比非肿瘤组织少，对TME的抑制更多。综上所述，与非肿瘤组织中的微环境不同，TME似乎保持稳定的抑制，并在HCC进展过程中略有变化。
图7 疾病复发患者非肿瘤组织TCR丰富度较高，肿瘤组织IR均匀度较低 研究比较了复发或转移的HCC患者肿瘤和非肿瘤组织的IR特征发现复发患者肿瘤中TRB、VDJ、IGH、IgG(图5A、B)均匀性明显低于无复发患者。相反，非肿瘤复发患者的TCR丰富度明显更高(图5C, D)，且复发患者的BCR SHM比未复发患者更强(图5H)，特别是肿瘤组织中的IgH和IgA，以及非肿瘤组织中的IgG和IgM。此外，该研究发现复发患者中IgG克隆率较高，而肿瘤组织中IgM克隆率较低(图5I)。对比有无复发患者的免疫浸润情况，在肿瘤中，发现肿瘤倍体、CTLA4、PD1、B7-1在复发患者中的表达明显高于未复发患者(图5E)；在非肿瘤组织中，复发患者的免疫评分及CD28、OX40、CD137、CD27、PD1、TIGIT、CD39的表达均显著高于无复发患者(图5F、G)。
图5 非肿瘤组织中较低的丰富度和较高的均匀度与较好的生存率相关 研究分析了该HCC队列的无进展生存期(PFS)、无复发生存期(RFS)和总生存期(OS)。研究发现，非肿瘤组织中TRA、TRB、TRD和TRG丰富度较低的患者PFS(图6A)和RFS(图6B)较长。同样，非肿瘤组织中较低的high – vdj丰富度与较好的RFS相关(图6B)。对于OS，该研究注意到非肿瘤组织中TRB和TRD丰富度在OS较长的患者中也明显较低。非肿瘤组织中IgA均匀度和TRG CDR3aa均匀度较高的患者生存期更长(图6C)。
图6 综上所述，非肿瘤组织中丰度越低、均匀度越高，HCC患者预后越好。 该研究为HCC的IR特征提供了一个全景图。作者通过结合大量TCR/BCR测序、大量RNA-seq、WES和HLA-seq，证明了IR特征及其与免疫浸润和分子特征的关系，发现IR特征随HCC进展而变化，尽管有些特征与其他特征一致。此外，作者发现非肿瘤组织中TCR丰富度可作为预测HCC预后的潜在指标。目前的发现可以作为进一步研究特定T细胞或B细胞的基础，以及通过结合单细胞测序，细胞表型，表达谱和功能分析开发新的免疫治疗策略。 参考来源：Shi Xie , Rong Yan , Anqi Zheng , Mengfen Shi , Longqing Tang , Xueying Li , Jiabang Liu , Yifan Gan1, Yu Wang , Deke Jiang , Li Liu , Hongkai Wu , Zhanhui Wang.Front Immunol. 2023 May 29:14:1161417. 杭州艾沐蒽生物科技有限公司成立于2016年，是国际前沿的专注于免疫驱动医学技术的国家高新技术企业。创始人团队来自美国芝加哥大学，在2010年开始使用免疫组基因高通量测序技术开展各种疾病相关研究，于2016年通过自主研发，全国首家推出NGS-MRD血液肿瘤微小残留病（MRD）检测Seq-MRD®，并授权泛生子（纳斯达克代码：GTH）使用。同时，公司拥有Immun-Traq®肿瘤治疗伴随诊断、Immun-Cheq® |T细胞免疫测评以及ImmuHub®免疫组测序科研服务产品，并布局有基于AI机器学习算法的T-classifier®肿瘤早筛、单细胞测序、TCR-T和抗体发现等平台管线。公司构建几十项发明专利和软件著作权为核心的自主知识产权体系，为医院临床、生命科学研究、新药开发等提供解决方案和产品。艾沐蒽专注于通过解码适应性免疫系统来改变疾病的诊断和治疗，并致力于推进免疫驱动医学领域发展。