COVID-19患者的已知风险因素主要是先前存在的疾病，例如老年、高血压、肥胖、糖尿病等，通过这些因素预测疾病严重程度是非常不准确的，而更精确的疾病严重程度分类可能会产生重要的临床结果。
到目前为止，绝大多数对COVID-19患者的健康状况或严重程度进行分类的尝试都依赖于TCR数据。BCR测序的使用被认为比TCR更困难，因为体细胞超突变（SHM）和CDR3区的多样性更高。然而，在某些情况下，BCR数据可能比TCR更具信息性，因为BCR会经历亲和力成熟以适应每种病原体。
2023年4月发表于Frontiers in Immunology的一篇文章报告了基于机器学习（ML）的BCR测序成功地将SARS-CoV2感染者与非感染者进行了分类，并确定疾病的严重程度，驱动这种分类的特征基于体细胞超突变模式。这些结果可用于建立和调整针对COVID-19的治疗策略，为未来的流行病学挑战提供新思路。
参考文献：Safra M, Tamari Z, Polak P, et al . Altered somatic hypermutation patterns in COVID-19 patients classifies disease severity. Front Immunol. 2023 Apr 19;14:1031914.
研究方法：样本采集（39名COVID-19轻度患者、12名严重感染患者和28个对照样本，采集PBMC）→bulk测序和单细胞测序→数据处理和统计→生成SHM模型→ML算法的训练和估计 →使用AA频率进行COVID-19分类→单细胞数据分析
BCR基因的使用无法对SARS-CoV2感染进行分类
图1.COVID-19 BCR重链的特征
与对照组相比，COVID-19患者的CDR3氨基酸（AA）长度无显著性差异（图1A），V基因突变分布仅略有增加（图1B），BCR克隆多样性明显偏低（图1C）。COVID-19患者的V基因使用率显著减少，但IGHV4-34，IGHV4-39和IGHV4-59的使用率增加，且重度患者高于轻度患者（图1D）。表明针对SARS-CoV2的抗体主要由这些基因组成。
作者根据V基因或V & J基因使用情况或V&J基因使用情况以及CDR3 AA中85%的相似性构建ML分类器。然而，这些模型的准确率低于70%，表明V或V&J基因的使用对SARS-CoV2感染应答的影响较小。
比较不同组之间的isotype频率发现，SARS-CoV2感染后IGD和IGM的频率降低，IGG的频率升高，而IGA的频率保持不变（图1E）。每个isotype的沉默突变（silent mutability）频率比较：感染后IGG和IGA的突变性降低，IGD和IGM的突变性增加，重症患者更高（图1F）。
BCR V基因AA组成成功对SARS-CoV2感染进行分类，并可能揭示病毒抗体的重要特征
图2.使用所有V基因位置的AA频率进行COVID-19分类
作者生成了一个包含10300列的表，为5个最常用的V基因家族（IGHV1-5）沿103个V基因位置（根据IMGT编号对齐）计算AA频率。使用这种方法获得了超过0.85的高 F1分数，以及相似水平的准确性、灵敏度和特异性（图 2A). 外部测试组的F1分数也高于0.85（图2B).作者提取了该算法使用的系数，对应于每个AA频率对疾病分类的贡献（图2D).另外作者计算了来自CoV-AbDab数据库中5000多种已知的抗SARS-CoV2抗体的这些分数，已知抗体的评分高于对照组以及大多数COVID-19感染库的评分（图2C），表明这些系数不仅对库水平有意义，而且对单个BCR序列也有意义。
COVID-19患者的类别转换B细胞的突变偏倚
图3.SHM单碱基突变、5-mers热点和冷点的沉默和替换突变
如图3A所示，COVID-19患者在胞嘧啶和鸟嘌呤（C和G）时的平均相对突变性降低，在腺嘌呤和胸腺嘧啶（A和T）的平均相对突变性增加。当只考虑沉默突变时，也得到了相同的结果（图3B）。
作者建立了一个基于沉默突变和替换突变的5-mer突变模型。这种模型结合了SHM和抗原驱动选择的影响。将5-mers分为发生在两个热点（WRC/GYW和WA/TW）、冷点（SYC/GRS）和所有其他中性位点，图3C、E显示了IGD/IGM和IGA/ IGG的水平。不同组间最显著的变化是COVID-19患者IGA/IGG中WRC/GYW位点减少，SYC/GRS增加，这种增加在严重感染的患者中没有出现。
为了了解这些模式是来自SHM还是来自抗原驱动的选择，作者建立了另一个模型，只考虑了沉默突变。图3D，F显示了相同序列基序的突变性分数。与图3C，E中观察到的模式相似，表明两组之间的变化是由于SHM特征的改变造成的。
Silent SHM模式对SARS-CoV2感染和严重程度进行了分类
图4.SHM重链可以对SARS-CoV2感染和严重程度进行分类
为了估计SHM模式的变化与SARS-CoV2感染之间的联系水平，作者建立了两个模型，一个使用了所有突变（图4A），另一个只使用了沉默突变（图4B）。考虑所有突变时，获得的F1评分和准确性、敏感性和特异性值均很高；只考虑沉默突变时，得到的F1评分和准确性的结果略低。这些结果印证了基因库之间的差异主要来自于SHM本身，而不是来自于抗原驱动的选择。
由于冷点基序的突变性在重症和轻度患者之间变化最大，作者仅使用该冷点的突变性评分建立了一个模型。在严重程度分类中，获得的F1评分和准确性约为0.75（图4C）。与重症患者相比，所有轻症患者的非零系数模式都有更高的突变频率（图4D）。
已知的SARS-CoV2抗体在COVID-19患者的浆母细胞中富集
图5.测序中的抗体克隆接近CoV-AbDab数据库中已知的COVID-19抗体
作者计算并总结了测序得到的抗体库与已公布的已知SARS-CoV2抗体相似的序列的频率。COVID-19患者中与已知抗体相似的频率高于对照组(图5A）。利用与已知COVID-19克隆相似的频率之和，我们在曲目分类中达到了70%以上的准确率，AUC为0.81（图5B）。
为了进一步探索与已知抗体的相似性，作者对另外13例轻度COVID-19患者的血液样本进行了10X基因组学单细胞测序。在其中7个抗体库中发现了与已知抗体相似的抗体序列（图5C），与批量测序队列相比，这些频率总体上较低。这可能是由于测序方法的差异，或者是因为在单细胞队列中，患者的平均诊断时间比整体队列要晚，因此可能有较低的SARS-CoV2特异性抗体水平。
图5D是根据单细胞表达谱对细胞类型分类的二维UMAP简化图，显示了一组独特的浆母细胞群（图中的紫色）。
已知的SARS-CoV2抗体在批量测序患者组、批量对照组、单细胞未细胞分类时和单细胞浆母细胞中的频率比较如图5E所示，已知抗体在COVID-19患者浆母细胞中的频率最高，这表明了对SARS-CoV2的典型反应。
验证
为了验证上述基于SHM突变模式的ML算法是否特定于 COVID-19，作者将算法应用于450份样本，样本来自乙型肝炎病毒感染、乙型肝炎病毒和流感疫苗接种以及几种自身免疫性疾病患者。这些样本中有94%被归类为健康，这表明这套算法不会将针对新病原体的免疫反应归类为COVID-19，它是特定于 COVID-19的。
沿V基因的AA频率模式是相对良好地对COVID-19进行分类的标志物，SHM突变模式可以实现对COVID-19严重程度分类，确定了与严重程度相关的SHM特异性模式，以及SARS-CoV2抗体中重要的AA组成。
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