文献分享|TCR测序应用于胃癌的相关研究

Gastric cancer

胃癌（GC）是世界上最常见和最致命的恶性肿瘤之一，是全球第三大癌症死亡原因。由于缺乏特异性的症状和有效的早期诊断方法，大多数胃癌患者在晚期被诊断为局部或远处转移，预后较差。因此寻找有助于早期诊断、风险评估和治疗的新的分子标志物很有必要。T细胞通过T细胞受体（TCR）特异性识别和结合肿瘤抗原mhc复合物，在抗肿瘤免疫中发挥重要作用，对TCR序列测序可用于评估癌症患者的免疫反应。

文献一

标题：Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in gastric cancer as determined by multiplex immunofluorescence and T cell receptor repertoire analysis

通过多重免疫荧光和T细胞受体库分析，确定NAC治疗对胃癌患者免疫微环境的影响

发表期刊：Journal for ImmunoTherapy of Cancer

发表日期：2022年3月

影响因子：12.469

背景

最近FDA批准了尼鲁单抗联合化疗用于晚期或转移性胃癌患者的初始治疗。这是第一个被批准联合免疫治疗和化疗治疗晚期胃癌的方案。采用联合治疗的患者中位生存期明显延长，然而，化疗增强免疫检查点封锁作用的机制仍然不明确。各种肿瘤相关免疫细胞（TAICs）亚型对治疗反应的贡献尚不清楚，很少有研究检测化疗后胃癌微环境的免疫学变化。阐明化疗诱导的肿瘤微环境（TME）的调节和确定哪种免疫治疗能提高抗肿瘤效果至关重要。

样本

采集1416例在胃或食管-胃交界处行胃切除术的胃癌患者的手术标本，这些患者被分为两个队列：1075例未经术前治疗的患者（队列1）和341例接受NAC治疗的患者（队列2）。NAC队列接受基于氟尿嘧啶的治疗方案：卡培他滨/S-1+奥沙利铂（XELOX或SOX）。另一个独立队列（队列3）是30例接受NAC治疗的II/ III期胃癌患者。获得他们NAC前的活检肿瘤组织和术后组织，进行多重免疫荧光和TCR测序分析。

方法

（1）TAIC分析，检测和量化免疫反应

（2) 多重免疫荧光

（3) TCR β链测序分析:对TCRβ链的CDR3区域进行免疫测序。

（4) 统计分析

结果

与NAC前样本相比，NAC后样本中TCR计数显著更低，但独特的TCR数量更高（图A.B）。NAC后TCR的比例显著升高，提示治疗后T细胞的多样性增加（图C)。

比较NAC前后TCR的分布表明，克隆扩增的T细胞有助于增加在NAC后样本中T细胞的多样性，这些细胞在化疗后被消除（图D，E）。

NAC后的D50指数显著高于NAC前，同时归一化Shannon熵的中位数也高于NAC前（图F，G）。

在NAC后，XELOX方案患者的归一化Shannon熵显著增加，而SOX组的TCR序列的多样性降低（如上图）。

结论

NAC使T细胞受体多样性增加，提示化疗可以增加T细胞的扩增，增强抗肿瘤免疫。

文献二

标题：Diversity index of mucosal resident T lymphocyte repertoire predicts clinical prognosis in gastric cancer

黏膜T淋巴细胞库多样性指数预测胃癌的临床预后

发表期刊：Oncoimmunology

发表日期：2015年4月

影响因子：8.11

背景

大多数人类实体肿瘤都被淋巴细胞浸润，长期以来人们一直怀疑免疫反应可以作为预测肿瘤进展或治疗疗效的基准。然而，肿瘤引起的免疫反应的复杂性使得原位免疫监测不现实和不确定，直到系统生物学和高通量客观测量方法的发展引发了一波免疫生物标志物发现的新浪潮。然而，大多数这些新的生物标志物对肿瘤预后预测的可靠性仍有待确定。

样本

收集28例胃癌患者的肿瘤组织、邻近正常黏膜组织和外周血样本，28例健康受试者的外周血样本。

方法

作者开发了一个高通量平台来分析TCR库。从不同数量的组织样本中，在没有额外的细胞分离程序的情况下，捕获TCRβ链编码的mRNA，并通过多重PCR进行条形码编码，进行基于离子激流PGM的深度测序。

结果

无论是考虑CDR3 AA序列的总数（图A）还是独特性（图B），胃癌患者的肿瘤组织、正常黏膜、外周血中CDR3长度分布均无显著差异。比较肿瘤患者和健康供体之间PBMC样本的CDR3长度分布，发现CDR3 AA克隆序列总数（图C）和独特性（图D）也均无显著差异。

对每个样本组的V和J使用情况的详细分析发现健康供体PBMC与肿瘤患者PBMC、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）和粘膜t细胞之间没有特定的偏倚（图E)。

根据28例患者的随访期和TIL、外周血T细胞、黏膜T细胞的多样性对其进行了分组。以归一化的香农多样性熵NSDE的中位数作为截止值，将这28例患者分为高组和低组。发现TIL和外周血T细胞的NSDE既不影响短期（18个月随访），也不影响长期（48个月随访）的生存率（图A、B）。然而，黏膜库TCR多样性指数可以清楚地预测癌症患者的短期和长期预后：多样性指标偏低，与患者临床预后较差相关（图C）。

结论

肿瘤邻近粘膜组织内的T淋巴细胞受体多样性指数是与胃癌预后相关的生物标志物。粘膜TCR库的高多样性与胃癌患者生存率的增加相关。

文献三

标题：Heterogeneity and evolution of tumour immune microenvironment in metastatic gastroesophageal adenocarcinoma

转移性胃食管腺癌中肿瘤免疫微环境的异质性和演变

发表期刊：Gastric Cancer

发表日期：2022年7月

影响因子：7.701

背景

近年来大量的临床试验表明，免疫检查点抑制剂（ICI）可以提高转移性GEA患者的生存率。然而，ICI应答者只构成了GEA患者的一小部分。肿瘤免疫微环境（TIME）及其异质性在许多癌症中与ICI反应有关，然而，原发肿瘤内、正常胃组织、原发GEA和转移部位的癌组织之间的异质性尚未被研究。

样本

5例转移性GEA患者的原发性胃肿瘤组织、邻近正常胃组织和淋巴结、腹膜、肝脏、子宫附着转移性肿瘤组织。术前采集每个患者的血样。

方法

（1）DNA提取、文库构建和全外显子组测序

（2）体细胞突变检测

（3）转移性seeding分析

（4）T细胞受体测序

（5）生物信息学分析

结果

在TCR异质性方面，转移组织样本中TCR异质性最高，共享克隆最少，原发肿瘤样本之间的TCR异质性较低，平均有10%的TCR克隆型共享。共进行113项两两比较，如何进行比较的示意图如图所示（图A）。

与原发肿瘤和正常胃组织相比，转移性样本具有更高的TCR丰富度（图B）和较低的克隆性（图C）、较高的Shannon熵（图D）。转移肿瘤组织样本中高扩增克隆（在一个样本中，>总TCR序列的0.1%）的比例较低（图E）。

血液与正常组织、原发肿瘤组织或转移性组织之间很少有TCR克隆型共享（图F）。然而，在不同的组织样本中的TOP100 TCR克隆，转移组织与血液的共享为56.5%，高于血液和原发肿瘤、正常组织的克隆共享（图G）。

结论

在转移肿瘤中存在一个高度异质性的T细胞群体。T细胞通过血液被输送到转移部位。然而，这些T细胞克隆尚未扩增，在转移中也不活跃。在血液中发现的转移性TCR库和循环TCR库之间的主要TCR克隆型有高度的重叠，这表明在血液中有高水平的免疫监测。

文献四

标题：Expansion of CD3+CD8+PD1+ T lymphocytes andTCR repertoire diversity predict clinical responses to adoptive cell therapy in advanced gastric cancer

CD3+CD8+PD1+ T淋巴细胞的扩增和TCR库多样性预测晚期胃癌过继性细胞疗法（ACT）临床反应的研究

发表期刊：American Journal of Cancer Research

发表日期：2022年12月

影响因子：5.942

背景

TCR库的多样性与肿瘤新抗原特异性T细胞的存在相关。来自循环血液的肿瘤抗原特异性TCR库与肿瘤浸润性CD8+PD1+细胞高度相似。为了确定CD8+PD1+ T细胞在ACT对胃癌患者获益中的作用，作者进行了这项研究，分析CD8+PD1+ T细胞的倍扩张能力和TCR库来预测接受ACT治疗的胃癌患者的临床效果。

样本

来自19例胃癌患者的标本：外周血、肿瘤细胞系和DC-CIK产物。

方法

（1）生成自体肿瘤细胞系

（2）制备DC-CIK产品

（3）生成CD8+PD-1+ T细胞

（4）流式细胞仪分析和分类

（5）肿瘤识别和细胞毒性分析

（6）TCR测序：将扩增第15天的TCR V和CDR3序列多样性与初始的TCR多样性进行比较。

（7）外周血免疫细胞的表型分析

结果

细胞培养第15天的Shannon指数较第0天显著降低，第15天的克隆性值显著增加，表明物种数量减少（图A）。在均匀度方面，第15天显著减少，表明TCR种群在第15天的异质性高于第0天（图A）。通过ROC分析得到了三个不同的截断值。后/前香农指数值<0.7的患者与≥0.7相比OS和PFS显著良好；后/前克隆值>1.7的患者OS和PFS显著良好；后/前均匀值>0.5的患者与≤0.5的患者OS或PFS无显著差异。(图B)

在培养15天后，共享序列的百分比显著增加（图C）。因此，能够杀死肿瘤的TCR序列是共享序列。

通过比较培养前后独特序列的比例和ROC曲线分析得到截止值。比较患者的PFS和OS（图D），发现独特序列减少，患者生存期改善。

结论

体外扩增后，TCR多样性降低，克隆性增加。患者预后明显改善，并与CD8+PD-1+t细胞扩增程度相关。CD8+PD-1+ T细胞可被鉴定为肿瘤反应性细胞。改变TCR种类可以预测CD3+CD8+PD1+t细胞的生长程度和ACT治疗的效果。

文献五

标题：A novel signature for stratifying the molecular heterogeneity of the tissue-infltrating T-cell receptor repertoire refects gastric cancer prognosis

组织浸润性TCR分子异质性分层的新特征可反映胃癌的预后

发表期刊：Scientific Reports

发表日期：2017年8月

影响因子：4.996

背景

胃癌的发生和进展与多种危险因素相关，而肿瘤浸润T淋巴细胞（TILs）的功能和分布在这一进展中起着至关重要的作用，因为T细胞在免疫介导的肿瘤监测中发挥着重要作用。此外，TILs的数量或比例在多种癌症中具有重要的预后价值，而直接靶向肿瘤相关抗原的TILs可能在防御肿瘤中很重要，这突出了免疫治疗的潜在临床应用。因此，迫切需要系统和全面地描述TILs的特征，以便更好地了解癌症免疫治疗的机制，并发现可用于评估治疗反应的预测性生物标志物。以往的大多数研究集中在肿瘤和健康对照组织之间的TCR库的差异，或者阐述TILs的空间异质性，然而在癌变过程中，特别是在癌前阶段，TCR库的变化尚未被确定。

样本

来自19例患者的41例不同病理阶段的胃组织样本，包括LGIN（低级别上皮内瘤变）、HGIN（高级别上皮内瘤变）、EGC（早期胃癌）和各自匹配的邻近组织。

方法

（1）样本采集和RNA分离

（2）对TCRβ CDR3区域测序和数据分析

（3）基因表达微阵列

（4）识别TVI相关基因的预后价值

结果

相邻粘膜、LGIN、HGIN和EGC组织的TOP100克隆的累积频率均急剧增加，所有样本的TOP100的平均累积频率几乎为50%，这表明整个TCR库主要由一小部分克隆所主导。

TOP100克隆的累积频率在胃病变和相邻组织之间没有明显的差异。说明在胃肿瘤发生过程中，TCR库的频率分布没有明显的变化。

LGIN与相邻组织的t细胞克隆重叠率高于HGIN与相邻组织和EGC与相邻组织的比率（上图a）。LGIN相邻粘膜对、HGIN相邻粘膜对和EGC相邻粘膜对共享克隆的累积频率呈下降趋势（上图b）。表明在胃肿瘤发生过程中，胃病变与邻近组织之间TCR库的相似性逐渐降低。

作者分析了LGIN、HGIN和EGC亚群的TOP100克隆（分别命名为L-100、H-100和E-100）与相应相邻组织的TCR库（称为A-TCR）之间的重叠率。L-100与A-TCR的平均重叠比率高于H-100与A-TCR和E-100与A-TCR的重叠比率（上图a)。随着肿瘤的疾病进展，共享克隆的平均累积频率逐渐降低。（上图b）

结论

本研究评估了LGIN、HGIN、EGC和匹配的邻近组织的TCR库，以阐明胃恶性转化过程中浸润组织TCR库的多阶段异质性。在肿瘤发生过程中，TCR库的变异程度逐渐增加。

艾沐蒽 ImmuHub^®技术方法

ImmuHub^®技术平台是基于第二代高通量基因测序（NGS）平台利用5’RACE或多重PCR技术，使我们能直接从基因组RNA或DNA来扩增TCR/BCR的全长序列或CDR3区序列，从而进行高通量测序和数据分析。是艾沐蒽开发的一套灵活度极高的TCR/BCR二代测序平台。

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什么是ImmuHub^®技术？

关于艾沐蒽

杭州艾沐蒽生物科技有限公司由美国芝加哥大学科研团队回国创办，是一家专注于通过解码适应性免疫系统来改变疾病的诊断和治疗，并致力于推进免疫驱动医学领域发展的国家高新技术企业。艾沐蒽站在适应性免疫系统研究的最前沿，自主研发的免疫医学平台可揭示和翻译适应性免疫系统的遗传密码，并能应用于癌症、自身免疫性疾病、传染性疾病等免疫介导性疾病的诊断、监测和治疗中。