Nature揭秘免疫相关不良事件：BULK测序与单细胞测序双管齐下，揭示T细胞的独特特征

将71个患者分为3个不相重叠的队列，一个单细胞研究队列和分为训练集和验证集的2个bulk队列（图1）。

图1

在所有亚群中，只有CD4效应记忆T（T_EM）细胞在治疗前血液中较高的水平与严重的irAE发展相关(P = 0.0002；图2c，d）。

图2

然后通过scRNA-seq结合scV (D)J-seq对13例患者的外周血样本进行了检测。scRNA-seq得到了7个主要的细胞分类谱系，在7种细胞类型中确定了32种不同的转录状态（图3a）。在这32种细胞状态中，作者发现CD4 T细胞状态5缺乏CCR7和SELL（CD62L）的表达，与CD4 T_EM细胞一致，与严重的irAE发育最为密切相关（图3b）。这种状态也与CyTOF测量的CD4 T_EM水平最为相关（图3b）。进一步分析发现，CD4 T细胞状态3也显示了与CD4 T_EM一致的表达谱（图3c）。当状态3与状态5结合时，所得到的聚类（CD4T 5 + 3）与严重的irAE发育和CyTOF所列举的CD4 TEM水平更显著相关（图3b）。

在经历严重irAEs的患者中，被激活的CD4T 5 + 3细胞的单细胞TCR克隆型多样性（香农熵）升高（受试者工作特征曲线下面积AUC= 0.90，P = 0.05；图3e）。这表明，在总的PBMCs中，激活的CD4 T_EM细胞的TCR丰富度是注定要发生严重irAE的患者的治疗前TCR多样性总体增加的基础。

当结合所有可评估的T细胞时，治疗前样本中的TCR高多样性与严重irAE发育之间显著相关（AUC = 0.80；图3e）。这种关联主要归因于具有效应记忆谱的CD4 T细胞（低CCR7和SELL）（图3f）。

总的来说，这些发现表明，基线时bulk外周血中CD4 T_EM细胞更多样化的TCR库，与严重ICI毒性的发展相关。

图3

在CIBERSORTx评估的13个PBMC亚群中，只有激活了的CD4 T_M细胞水平与严重的irAE发育相关（图4a）。bulk外周血中较高的TCR克隆型多样性也预示着严重irAE的发展（图4b）。

鉴于这些结果，作者生成了一个整合这两个特征——激活的CD4 T_M细胞丰度和整体TCR多样性的复合模型（图4c）。生成的复合模型在bulk队列1中产生AUC为0.85（P = 0.02），在bulk队列2中产生AUC为0.9（P =0. 0004），优于任何一个单独的特征。

接下来探索复合模型是否可以独立于关键的患者参数预测严重的irAE。发现，无论ICI治疗类型、ICI反应状态、年龄、性别、黑色素瘤亚型或受影响的器官系统如何，无论是在bulk队列2还是留一交叉验证（LOOCV）评估的两个bulk队列中，该模型仍然具有预测性（图4d）。

此外，在接受联合ICI治疗的患者中，复合模型在bulk队列1中产生AUC为0.2（P = 0.04），LOOCV 的AUC为0.86（P = 0.01），用于预测所有可评估患者的严重 irAE 发展（图4d）。

作者还探讨了模型性能作为irAE分级和器官系统受累的功能。尽管针对单一分类结果（严重与无严重irAE）进行训练，但是治疗前综合模型评分随着irAE严重程度而增加（图4e）。

为了测试治疗前复合模型是否能够预测严重irAE发生的时间，我们接下来通过在bulk队列1中定义一个最佳切点，将患者分为高组和低组。在bulk队列2中，高组患者在治疗开始后的1.74个月内经历了严重irAE，而低组的绝大多数患者从未经历过严重irAE（P < 0.0001，风险比（HR）= 11.6；图5a）。

图4

首先评估了治疗开始后的TCR克隆扩增（即克隆优势），与未发生严重irAE的患者相比，严重irAE患者的TCR克隆扩增和持续性T细胞克隆（定义为配对治疗前和治疗早期的血液样本之间共享的生产性TCR-β CDR3核苷酸序列）显著增加(图5b）。

在进行scRNA-seq和单细胞TCR测序（scTCR-seq）（n = 3）的严重irAE患者中，观察到通过scRNA-seq分析鉴定的CD4 T 5 + 3群体中，持续性的CD4 T细胞克隆高度富集（图5c）。

作者还探讨了治疗后早期TCR克隆扩增的程度是否与严重irAE发生的时间相关。发现，TCR克隆扩增程度较高的患者都会更早发生严重的irAE（P=0.003，图5d）。

图5

图6