导读
免疫组测序，相较于全基因组测序、全外显子测序、基因panel来说，大家会显得陌生和比较难理解。简单言之，免疫组其实是某种程度的捕获基因组测序，也是一种基因panel，关注的是 608-665 IG and TR genes，这段基因具有较高多样性，理论上能达1016~1018的种类 。区别在于普通的基因panel需要在每个基因的每个外显子上面设计探针，保证全方位的覆盖，而免疫组需要设计有限引物覆盖高多样性的 IG 和TR。
关于免疫组T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）的基础知识详见可参考TCR/BCR免疫组测序与应用方向。
第一部分：艾沐蒽ImmuHub® 艾沐蒽开发的ImmuHub®技术平台利用5’RACE（RNA适用）或多重PCR技术（DNA适用），使我们能直接从基因组RNA或DNA来扩增TCR/BCR的全长序列或CDR3区序列（文库构建），从而进行高通量测序和数据分析。 图1 数据分析分为基础分析与深度分析。在标准分析报告中，艾沐蒽提供了三种深度分析：V-J基因片段组合图，Top10 CDR3序列长度分布柱状图和克隆频率分类呈现。 对下机测序数据进行质量评估，去除原始数据（raw data）中的无效序列，获得有效测序数据（clean data）。过滤后数据与国际免疫遗传学数据库（IMGT，http://www.imgt.org）*序列比对，获得每条序列中V、D、J和C基因片段ID，然后在具有合格的CDR3区域的基础上，鉴定出克隆的CDR3核酸序列以及氨基酸序列，并对得到的每种克隆进行计数和频率的计算。结果示例如下图所示： （*IMGT数据库用于分析抗原受体、免疫球蛋白（抗体）的基因（等位基因）以及T细胞受体，整理从鱼类到人类等颌骨脊椎动物的巨大且复杂的适应性免疫）
图2 （1）Clone ID:每种克隆编号，从0开始按顺序编号。如有未出现的编号，表示该克隆为out-of-frame或中间有Stop Condon的，通常认为是不表达的克隆，在数据分析时一般会被过滤掉 （2）Clone Count:每种克隆的总数 （3）Clone Fraction: 表示每种克隆占总TCR克隆种类的频率的百分比 （4）CDR3 Gene Sequence: CDR3核酸序列 （5）CDR3 AA Sequence: CDR3氨基酸序列 （6）V/D/J Segment: VDJ基因片段ID
第二部分：免疫组测序分析
图3
图4V -J 基因片段组合图体现的是各个样本的V-J基因片段使用频率和组合频率，可说明免疫系统多样性。如图所示，每一个色块代表一个基因片段，上段为 V 片段，下段为 J 片段，色块越宽代表这个片段使用频率越高，连线越多，表示这种 V-J 组合频率越高。
图5
艾沐蒽提供的各个样本的Top10 CDR3序列长度分布柱状图按照频率选取Top10以及其他（Other）克隆（以CDR3的氨基酸序表示）的CDR3核酸长度分布，X轴为CDR3核酸长度，Y轴是频率，不同颜色表示不同克隆，彩色表示Top 10克隆，灰色的表示除Top 10以外的其他克隆。
图6
CDR3由V、（D）、J三个基因编码，具有高可变性，是决定T/B细胞克隆类型的区域，同时在抗原识别中起关键作用。自然状态下，CDR3的长度分布呈正态分布。如图所示，通过将CDR3序列按照一定的长度（此处选取K=3）进行打断，可获得kmer统计结果，有报道称可以根据其降维结果对不同的肿瘤时期进行分型。
图7克隆性蜗牛图可呈现克隆频率分类。
以TCRβ为例：
第一层包括“1”、“2”和“3+”，分别表示测序测到1次、2次和3次以上的TCR克隆序列的百分比。“1”和“2”所占的比例是非常重要的，其与初始T细胞息息相关，能影响T细胞多样性的计算。
第二层的Q1-Q5表示每20%的TCR克隆序列所占的比例（TCR克隆频率由高到低排序），这能直观反映TCR克隆性。
第三层是前top5种TCR克隆的CDR3区域的氨基酸序列。该层区域越宽，说明某TCR克隆性增殖越高。
第三部分：免疫组测序应用——克隆性蜗牛图
在艾沐蒽合作发表的《Quantitative characterization of T-cell repertoire alteration in Chinese patients with B-cell acute lymphocyte leukemia after CAR-T therapy》，通过ImmuHub® TCR测序，对中国白血病患者CAR-T治疗后T细胞组库（TCR）变化进行研究。如下图所示，通过TCR测序对B-ALL患者CAR-T治疗前和治疗后多个时间点的外周血和骨髓样本进行研究。蜗牛图结果表明经过CAR-T治疗后，患者的外周血和骨髓中均会出现明显的T细胞克隆性增殖。
图8（图片来源：https://www.nature.com）
参考文献：
Wang X, Hu Y, Liu X, Yu J, Xu P, Wei G, Jin C, Wu W, Fu H, Ding L, Ni F, Zhang H, Liang Z, Wang B, Li X, Wei C, Deng Y, Shi J, Xiao L, Wu Z, Sun T, Huang H. Quantitative characterization of T-cell repertoire alteration in Chinese patients with B-cell acute lymphocyte leukemia after CAR-T therapy. Bone Marrow Transplant. 2019 Dec;54(12):2072-2080. doi: 10.1038/s41409-019-0625-y. Epub 2019 Aug 5. PMID: 31383996.
在合作发表的《The Relationship Between Convergent IGH Signatures and Severity of COVID-19 Patients by Next-Generation Sequencing of B-Cell Repertoire》新冠研究中，通过ImmuHub® BCR测序平台，发现B细胞可以识别新型冠状病毒（SARS-CoV-2）并产生克隆性增殖。如下蜗牛图分析结果所示，被用来评估患者的IGH库动态和治疗效果。图中显示了IGH的互补决定区（CDR3）的前五个克隆的氨基酸序列。七名危重患者被分为改善组和恶化组，治疗7天后，改善组出现克隆性增殖，前5个克隆的总频率增加，然而，在恶化组中，前5个克隆总频率减小。
图. IGH 的蜗牛图。七名患者在治疗后和治疗前的蜗牛图。扇形区域描绘了相应的克隆频率。图中“1”的区域代表测序测到1次的频率。弧度面积越大意味着的克隆频率越高。图中显示了 IGH 的互补决定区 (CDR3) 的前五个克隆的氨基酸序列。
参考文献：
Cai, Hongliu et al. “The Relationship Between Convergent IGH Signatures and Severity of COVID-19 Patients by Next-Generation Sequencing of B-Cell Repertoire.” Frontiers in microbiology vol. 12 833054. 9 Feb. 2022, doi:10.3389/fmicb.2021.833054
总结
艾沐蒽提供以上三种深度分析作为标准分析报告。若有其他更深层次的需求，艾沐蒽不仅能提供二十余种深度分析，还可以实现各种个性化需求分析。你可以什么都不相信，但是一定要相信艾沐蒽的技术。
杭州艾沐蒽生物科技有限公司由美国芝加哥大学科研团队回国创办，是一家专注于通过解码适应性免疫系统来改变疾病的诊断和治疗，并致力于推进免疫驱动医学领域发展的国家高新技术企业。艾沐蒽站在适应性免疫系统研究的前沿，自主研发的免疫医学平台可揭示和翻译适应性免疫系统的遗传密码，并能应用于癌症、自身免疫性疾病、传染性疾病等免疫介导性疾病的诊断、监测和治疗中。
