姚诗雨 （杭州艾沐蒽生物科技有限公司）
到目前为止，大约一半的已发表的文献中使用基因组DNA（gDNA）样本为免疫组库测序，而另一半使用RNA。但是我们会推荐选择用RNA作为文库备制的起始模板。
利用gDNA存在的主要问题是其包容性。只有一部分的模板DNA，可以用于PCR反应。每个人体细胞有约6.6pg的gDNA，重组的V(D)J基因只能占到其中非常少的一部分。所以， 如果PCR反应中使用了100ng gDNA，这只能够代表约16000个细胞，导致其数量非常有限。虽然可以使用更多的gDNA，但总的来说，PCR反应模板的量也是有个上限的。相反，从RNA 反转录得到的cDNA具有免疫特异性，能最大限度地减少参与PCR反应时所需的模板量，排除不必要的和潜在的会影响PCR反应结果的gDNA。
第二个问题是使用gDNA作为模板会产生背景杂质。正如下面的图示表明，V(D)J重组后，那些不参与重组的V、D和J基因，但其仍然在基因组中，且可以作为引物完美的结合位点。同时，TCR gDNA里也有大量的内含子（特别是J和C之间），这些都会在PCR扩增的时候产生背景杂质，增加引物消耗，并导致偏差。
TCR V(D)J 基因重组
使用基因组DNA也有一定的优点。其样品更容易获得，甚至可以使用活检标本的组织或切片。 此外，因为每个细胞只有一个重新排列成功的V(D)J基因，它可以更好的反映整体的TCR数量。 换句话说，由于一个细胞对应一组V(D)J基因，每个成功重组的V(D)J基因不会因为其是否表达而影响其TCR总数（表达在T细胞表面的和没有表达在T细胞表面的总和）。然而，我们还可以反驳说，对RNA表达下的T和B细胞受体进行测序，能够更好的反映其表达后的功能状态。那么到底选择DNA 还是RNA ？真正的答案取决于你的研究目的。如果你正在寻找的某个克隆型的变化，gDNA和RNA都可以满足。但是，如果你需要看到更广泛的多样性，RNA可能会更好。
最后，如果你是想检测到整个TCR基因全长序列的话，只能使用单对引物PCR的建库方法，由于目前Illumina平台测序长度的限制，所以用gDNA的方法是无法测通整个TCR基因序列的。而TCR mRNA的长度通常在400bp~600bp，Illumina MiSeq 300X2 PE平台就可以完成。
